1、目的： 體外培養(yǎng)正常成人皮膚成纖維細(xì)胞，并對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行鑒定，觀察川芎嗪，苦參堿，積雪草甙對(duì)正常成人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響以及對(duì)其自分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響。 方法： 1取正常成人包皮，用組織培養(yǎng)法進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)。 2鑒定成纖維細(xì)胞： (1)形態(tài)學(xué)觀察：將成纖維細(xì)胞用0.25％胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞爬片，乙醇固定，鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。 (2)免疫組織化學(xué)鑒定：取上

2、述細(xì)胞爬片，免疫組織化學(xué)測定細(xì)胞波形蛋白和角蛋白表達(dá)的情況。 3以不加藥的含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液為對(duì)照組，設(shè)苦參堿，川芎嗪，積雪草甙3個(gè)加藥組，各設(shè)5個(gè)不同的濃度，加入培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，于24小時(shí)，48小時(shí)后在倒相差顯微鏡下攝像，并且作MTT，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測OD值。 4同上分組，培養(yǎng)24小時(shí)后分別取細(xì)胞上清液用ELISA方法測定細(xì)胞上清液中TGF—β1的含量。 5乳酸脫氫酶(LDH)

3、活性測定，同上分組，取上述細(xì)胞上清液，用自動(dòng)生化分析儀測定，測定對(duì)照組LDH的含量。 6統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用單因素方差分析(one—wayNAOVA)，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0．05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1人成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定：HE染色后光鏡觀察顯示細(xì)胞為多角形或長梭形。波形蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示成纖維細(xì)胞胞漿染成深棕色，為陽性。 2

4、成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化對(duì)照組鏡下可見外形狹長、胞核呈梭形、走向趨于一致的細(xì)胞，多呈平行排列并有一定弧度。細(xì)胞中央有圓形或卵圓形核，部分細(xì)胞可見向外伸出2-3個(gè)長短不一的突起，為成纖維細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞間隙變窄，呈條索狀分布。 積雪草甙實(shí)驗(yàn)組：當(dāng)藥物濃度為0.25mg/ml時(shí)，24小時(shí)后細(xì)胞就變短，出現(xiàn)少許脫壁、漂浮的細(xì)胞。在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)，隨著培養(yǎng)濃度的增加，貼壁細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少，細(xì)胞間隙變大，培養(yǎng)液中成

5、形的細(xì)胞少見。當(dāng)藥物濃度達(dá)到2.5mg/ml時(shí)細(xì)胞即變圓，大量細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。苦參堿實(shí)驗(yàn)組：當(dāng)藥物濃度為0.5mg/ml時(shí)，在24小時(shí)個(gè)時(shí)間段內(nèi)，隨著培養(yǎng)濃濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞梭狀突起回縮，與鄰近細(xì)胞接觸減少，細(xì)胞間隙變大，形態(tài)逐漸變圓、脫壁。當(dāng)藥物濃度達(dá)到5mg/ml時(shí)，48小時(shí)后細(xì)胞變圓，大量細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。 川芎嗪實(shí)驗(yàn)組：在24小時(shí)時(shí)間段內(nèi)，當(dāng)藥物濃度為0.5mg/ml時(shí)，隨著培養(yǎng)濃濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量減

6、少，細(xì)胞梭狀突起回縮，與鄰近細(xì)胞接觸減少，細(xì)胞間隙變大，形態(tài)逐漸變圓、脫壁。當(dāng)藥物濃度達(dá)到5mg/ml時(shí)，24小時(shí)后細(xì)胞即變圓，大量細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。 3各組中藥培養(yǎng)24小時(shí)后，取細(xì)胞上清液，用Elisa方法測定細(xì)胞上清液中TGF—β1的含量．各組中TGF—β1的OD值均很低，與對(duì)照組經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著性差異(P＞0.05)4一定濃度下的積雪草甙，苦參堿，川芎嗪對(duì)成纖維細(xì)胞LDH活性的無影響。 結(jié)論： 在一定濃