1、目的：觀察不同濃度的BDNF對(duì)小鼠體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能的影響，選取最佳培養(yǎng)濃度，以BDNF為對(duì)照，進(jìn)一步研究補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)DOR小鼠體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能的影響，為中醫(yī)應(yīng)用“腎主生殖”及“沖任學(xué)說(shuō)”治療DOR提供更有力的依據(jù)。
　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)一：選取SPF級(jí)8-10周齡ICR雌性小鼠40只，每只小鼠在動(dòng)情前期注射孕馬血清(PMSG)IO IU，48小時(shí)后處死，采集其未成熟卵母細(xì)胞，分別用含有

2、Ong/ml、 lng/ml、5ng/ml、10ng/ml(分別為 BDNF-0組、BDNF-1組、BDNF-5組、BDNF-10組)的BDNF培養(yǎng)液體外培養(yǎng)24小時(shí)。利用PCR方法檢測(cè)卵母細(xì)胞內(nèi)mt DNA拷貝數(shù)，采用線粒體熒光探針（mitotracker)檢測(cè)線粒體定位，采用FITC-PNA對(duì)皮質(zhì)顆粒進(jìn)行熒光染色，觀察皮質(zhì)顆粒分布。選取SPF級(jí)10-12周齡昆明種雄性小白鼠，將雄鼠頸椎脫臼處死，剪碎附睪尾取精，精卵體外受精培養(yǎng)。受精

3、后觀察卵母細(xì)胞受精、2-細(xì)胞及囊胚形成情況。
　　2.實(shí)驗(yàn)二：選取SPF級(jí)8-10周齡ICR雌性小鼠40只，按體重分層法隨機(jī)分配，每組各10只，分為空白組、模型組、BDNF組、中藥組。動(dòng)物模型采用Cy進(jìn)行造模，模型組、BDNF組和中藥組腹腔內(nèi)一次性注射Cy75mg/kg?？瞻捉M、模型組、BDNF組小鼠每日給予生理鹽水12mg/kg，中藥組小鼠每日給予補(bǔ)腎調(diào)沖方水煎劑20mg/kg/d(相當(dāng)于成人臨床等效劑量，按照小鼠體重系數(shù)換算）

4、。各干預(yù)措施均采用灌胃方式給藥，連續(xù)4周。每只小鼠在動(dòng)情前期注射PMSG10IU，48小時(shí)后處死，采集其未成熟卵母細(xì)胞，空白組、模型組、中藥組在KSOM-AA培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，BDNF組在培養(yǎng)液中添加5ng/ml的BDNF進(jìn)行培養(yǎng)，各組均培養(yǎng)24小時(shí)。利用PCR方法檢測(cè)卵母細(xì)胞mt DNA拷貝數(shù)，采用線粒體熒光探針(mitotracker)檢測(cè)線粒體定位，采用FITC-PNA對(duì)皮質(zhì)顆粒進(jìn)行熒光染色，觀察皮質(zhì)顆粒分布。選取SPF級(jí)10?1

5、2周齡昆明種雄性小白鼠，將雄鼠頸椎脫白處死，剪碎附睪尾取精，精卵體外受精培養(yǎng)。受精后觀察卵母細(xì)胞受精、2-細(xì)胞及囊胚形成情況。
　　結(jié)果：
　　1、實(shí)驗(yàn)一
　　1.1各組小鼠體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量比較：（l)mtDNA拷貝數(shù)：各組的mtDNA拷貝數(shù)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2)線粒體定位：BDNF-5組和BDNF-10組中IVM卵母細(xì)胞的線粒體均勻分布的比例分別顯著高于BDNF-0組和BDNF-1組。BDNF-0組與 BD

6、NF-1組、BDNF-5組與BDNF-10組組間相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BDNF-0組與 BDNF-5組、BDNF-0組與 BDNF-10組、BDNF-1組與 BDNF-5組、BDNF-1組與 BDNF-10組組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3)皮質(zhì)顆粒分布：BDNF-5組和BDNF-10組皮質(zhì)顆粒呈III級(jí)分布的比率明顯高于BDNF-0組和BDNF-1組。BDNF-0組與BDNF-1組、 BDNF-5組與BDNF-10組組間相比差異均無(wú)

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BDNF-0組與BDNF-5組、 BDNF-0組與 BDNF-10組、BDNF-1組與 BDNF-5組、BDNF-1組與 BDNF-10組組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.2各組小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的比較：（1)卵母細(xì)胞受精率：各組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2)2-細(xì)胞率和囊胚率：BDNF-5和BDNF-10組的IVM卵母細(xì)胞的2-細(xì)胞率和囊胚率顯著高于BDNF-0組和BDNF-1組。BDNF-0組與BDNF-1組、

8、BDNF-5組與BDNF-10組組間相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BDNF-0組與BDNF-5組、BDNF-0組與 BDNF-10組、BDNF-1組與BDNF-5組、BDNF-1組與BDNF-10組組間相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、實(shí)驗(yàn)二
　　2.1補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)各組小鼠體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)量比較：（1) mtDNA拷貝數(shù)：空白組、 BDNF組、中藥組mtDNA拷貝數(shù)均明顯高于模型組，相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻捉M、 BDNF組、中

9、藥組三組之間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2)線粒體定位：空白組、 BDNF組、中藥組線粒體均勻分布比例均明顯高于模型組，相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻捉M、BDNF組、中藥組三組之間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3)皮質(zhì)顆粒分布：空白組、BDNF組、中藥組皮質(zhì)顆粒處于III級(jí)分布的比例明顯高于模型組，相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻捉M、BDNF組、中藥組三組之間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2各組小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的比較：（1

10、)卵母細(xì)胞受精率：空白組、BDNF組、中藥組的受精率均較模型組明顯增高，相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白組、BDNF組、中藥組三組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2)2-細(xì)胞率和囊胚率：空白組、 BDNF組、中藥組的受精率均較模型組明顯增高，相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白組、 BDNF組、中藥組三組之間兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.BDNF可以促進(jìn)外成熟卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的成熟，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。
　　

11、2.BDNF可以提高胚胎發(fā)育潛能。
　　3.經(jīng)過(guò)不同濃度對(duì)比，體外成熟培養(yǎng)液中添加5ng/ml的B D N F即可提高卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。
　　4.補(bǔ)腎調(diào)沖方和BDNF均可以促進(jìn)D O R小鼠體外成熟卵母細(xì)胞質(zhì)成熟，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量。
　　5.補(bǔ)腎調(diào)沖方和BDNF均可以提高D O R小鼠胚胎發(fā)育潛能。
　　6.在提高IVM中卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能方面，補(bǔ)腎調(diào)沖方與BDNF具有相似的效果，為中醫(yī)“腎主生