1、植物非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTP)是一類廣泛存在于高等植物中的堿性小分子蛋白，編碼nsLTP的基因在許多植物中都以基因家族的形式存在，如擬南芥、大麥等。nsLTP成員具有不同的生物學(xué)功能，主要涉及角質(zhì)合成，用以調(diào)節(jié)脂質(zhì)儲藏的分解代謝的β氧化、體細胞胚胎形成、植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、參與植物有性生殖、花粉發(fā)育、對病原物的防御以及對生物和非生物脅迫的應(yīng)答等。明確不同成員在植物抗性形成方面的作用，對于調(diào)控植物抗性和利用基因工程改良植物抗性有重要意義。

2、本文克隆得到了蠟梅脂轉(zhuǎn)移基因家族4個成員，并進行了啟動子分離工作，利用生物信息學(xué)、熒光定量PCR、原核表達等方法對獲得的蠟梅脂轉(zhuǎn)移蛋白基因家族成員抗逆性的差異進行了分析。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴在已構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫及EST分析的基礎(chǔ)上，通過對文庫cDNA克隆全長測序，得到了4個編碼蠟梅非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白的基因(nsLTP)，分別命名為CpLTP1，CpLTP2，CpLTP3和CpLTP4，GenBank登錄號為

3、FJ889521，F(xiàn)J904082，F(xiàn)J904083和FJ904084。它們的cDNA全長分別為611、1016、656和1997 bp，ORF分別為360、360、351和660 bp，無內(nèi)含子，5’和3’端的非翻譯區(qū)的長度不等，存在的調(diào)控基序有所不同。運用生物信息學(xué)手段對蠟梅nsLTP基因家族4個成員編碼蛋白CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3和CpLTP4的結(jié)構(gòu)特點與性質(zhì)進行了分析，CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3具有

4、明顯的植物脂轉(zhuǎn)移蛋白nsLTPI類的特征，分子量都為9KD，含有保守的4個螺旋區(qū)、8個半胱氨酸位點和脂質(zhì)結(jié)合基序，具有明顯的信號肽序列，定位于細胞外的可能性最高，進一步的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測也顯示能夠形成管狀的疏水腔。而CpLTP4與其他3個編碼蛋白顯著不同，具有較高的分子量(19.7KD)，雖然同樣具有8個保守的半胱氨酸位點，但第8個位點的位置與nsLTPI類有一定的差異，細胞定位有所不同，定位于質(zhì)膜的可能性最高，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示形成上寬下窄

5、的類似于三角形的疏水腔，聚類分析時與同樣高分子量的剛毛怪柳、蓖麻等的脂轉(zhuǎn)移蛋白聚在一支，這種高分子量的脂轉(zhuǎn)移蛋白有可能形成一個新的類別。
　　 ⑵功構(gòu)建LTP1—pET、LTP2—pET、LTP3—pET、LTP4—pET原核表達載體，轉(zhuǎn)化Origami(DE3)表達菌株，通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化，在28℃、0.5m MIPTG、誘導(dǎo)6h能夠獲得較好的可溶性表達。利用His—Bind蛋白純化回收試劑盒獲得4個純化的重組蛋白。體外抑菌試驗

6、結(jié)果表明，4個重組蛋白都具有抑菌活性但有差異，其中LTP4重組蛋白抑制小麥赤霉菌生長的能力最強，LTP1最弱。對于細菌的抑制活性還有待進一步試驗驗證。
　　 ⑶對蠟梅植株進行低溫、干旱、高鹽和ABA誘導(dǎo)處理，利用熒光定量PCR技術(shù)分析蠟梅nsLTP基因家族4個成員在蠟梅葉片中的表達情況，結(jié)果表明，4個nsLTP基因在蠟梅幼苗中的表達受干旱、ABA、低溫和NaCl處理的影響程度不同。CpLTP1、CpLTP2，CpLTP3基因在脅

7、迫處理下表達總體下調(diào)，而CpLTP4基因在脅迫處理下表達總體上調(diào)，其中在低溫處理下表達量最高。結(jié)果表明雖然CpLTP1，CpLTP2，CpLTP3基因來自于同一基因家族，但其功能上具有明顯的差異，可能在蠟梅幼苗的水分平衡、耐受低溫、離子代謝等過程中發(fā)揮著不同的作用，CpLTP4基因可能對蠟梅抵抗非生物脅迫起更重要的作用。
　　 ⑷利用hiTAIL—PCR法分離分別得到了CpLTP3，CpLTP4基因5’端上游的一段長1298bp

8、和838bp的序列，二者的序列差異較大，Identity值為27.75％。經(jīng)序列測定及軟件分析表明，這兩個序列具有典型的啟動子結(jié)構(gòu)，除含有TATA—box、CAAT—box等啟動子基本元件，另外都含有較多的光應(yīng)答元件、與植物非生物脅迫相關(guān)的一些響應(yīng)元件，如ABRE、G—BOX、HSE。僅在CpLTP4pro發(fā)現(xiàn)GARE—motif、TATC—box、MBS、TC—rich repeats，在CpLTP3pro啟動子發(fā)現(xiàn)與細胞周期調(diào)控有關(guān)

9、的順式調(diào)控元件MSA—like和胚乳表達必須的順式調(diào)控元件Skn—1_motif。將克隆得到的蠟梅啟動子CpLTP3pro、CpLTP4pro代替pBI121中的CaMV35S啟動子構(gòu)建成適于瞬時表達研究的植物表達載體pBI12l—CpLTP3pro和pBI121—CpLTP4pro。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達研究，在GA3誘導(dǎo)下，CpLTP4pro能夠驅(qū)動GUS基因在煙草葉片中的表達，而CpLTP3pro不能。在CpLTP3pro、Cp