1、目的:
　　在天然免疫中發(fā)揮重要作用的KIR基因家族，包含14個(gè)功能性基因和2個(gè)假基因。KIR基因不僅存在等位基因水平的多態(tài)性，而且還存在單倍型組成的差異。鑒定KIR等位基因具有功能性及臨床意義。迄今國際上只有鑒定KIR基因有無的低分辨水平試劑盒，尚無高分辨水平KIR基因測序分型商品化試劑盒。文獻(xiàn)業(yè)已報(bào)道的KIR測序分型方法，有的僅針對(duì)部分外顯子進(jìn)行測序分型;有的雖涵蓋了全部外顯子，但由于退火溫度、PCR擴(kuò)增片段長度及擴(kuò)增時(shí)間的不

2、同，難以實(shí)現(xiàn)高通量化同步擴(kuò)增。技術(shù)上的瓶頸導(dǎo)致了KIR等位基因多態(tài)性數(shù)據(jù)的缺乏:系統(tǒng)全面報(bào)道14個(gè)功能性KIR基因高分辨水平多態(tài)性的研究論文，中國漢族人群尚屬空白，國際上僅見于非洲、高加索、日本及毛利人群。
　　方法:
　　根據(jù)知情同意原則，采集306例南方漢族志愿獻(xiàn)血者無關(guān)個(gè)體的血樣。
　　本文利用在國家自然科學(xué)基金(81373158)資助下建立的14個(gè)功能性KIR基因同步測序分型專利技術(shù)，對(duì)306例南方漢族獻(xiàn)血者樣

3、本進(jìn)行了檢測:(1)采用3～4對(duì)KIR基因特異性PCR引物對(duì)每個(gè)功能性KIR基因的全部編碼區(qū)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果與KIR SSP商品化試劑盒檢測結(jié)果相比較。陽性特異性擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙向測序反應(yīng)，ABI3730測序儀電泳檢測。(2)針對(duì)測序分型中的模棱兩可等位基因組合，采用“組特異性PCR擴(kuò)增—純化—再測序”方法鑒定確切的基因型。(3)測序分型中出現(xiàn)無完全匹配結(jié)果的樣本，重新采集新鮮血樣，通過分子克隆測序鑒定可能的K

4、IR新等位基因，其編碼序列分別提交GenBank和WHO IPD-KIR數(shù)據(jù)庫。(4)統(tǒng)計(jì)檢出的KIR等位基因、精細(xì)水平KIR基因組合型及其檢出率，進(jìn)行單核苷酸水平多態(tài)性及進(jìn)化分析。
　　結(jié)果:
　　(1)本文獲得了44500余條序列，共檢出116種等位基因，其中46種為WHO正式命名的新等位基因。結(jié)構(gòu)基因2DL4、3DL2、3DL3檢出的等位基因分別為11、18、19種，多態(tài)性豐富;而激活型KIR等位基因多態(tài)性則相對(duì)保守，

5、如2DS5檢出1種、2DS2和2DS3均檢出2種、2DS1檢出3種。(2)306例樣本中檢出高分辨水平KIR基因組合型258種，其中AA、AB及BB型高分辨水平KIR基因組合型分別為124種、119種、15種。(3)編碼胞外結(jié)構(gòu)域的第3～5外顯子和編碼胞漿尾的第7～9外顯子的平均核苷酸突變率(π）遠(yuǎn)高于編碼引導(dǎo)肽的第1～2外顯子和編碼穿膜區(qū)的第6外顯子。(4)不同的KIR基因編碼區(qū)的γ(dn/ds)值各不相同，說明其突變在進(jìn)化過程中受到

6、的自然選擇作用各不一樣。
　　結(jié)論:
　　本文創(chuàng)建了KIR模棱兩可等位基因組合的鑒定方法。篩選和發(fā)現(xiàn)了46個(gè)WHO認(rèn)可的KIR新等位基因，其序列均已提交WHO IPD-KIR數(shù)據(jù)庫供全球同行使用，有助于提高南方漢族人群KIR基因精細(xì)分型的準(zhǔn)確率和涵蓋率。同時(shí)首次獲得了完整的南方漢族人群的KIR等位基因、精細(xì)水平KIR基因組合型、單核苷酸多態(tài)性及進(jìn)化樹分析等多態(tài)性數(shù)據(jù)，可為移植、疾病關(guān)聯(lián)研究、KIR測序分型試劑盒的研發(fā)以及人類