1、結核?。╰uberculosis,TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）引起的單一病原菌造成人類死亡的重大疾病，據(jù)WHO2015年最新統(tǒng)計結果顯示，全球新增感染結核病人高達1040萬人，其中，合并艾滋病毒（HIV）感染人數(shù)達到120萬人，中國、印度等發(fā)展中國家占新增病例的60％，僅2015年一年死于結核病的人數(shù)為140萬，其中40萬人死于結核病合并HIV感染，近十幾年來，由于艾滋病感染以及

2、免疫抑制劑廣泛使用，使得MTB耐藥率增加。因此，尋求一種有效預防MTB傳播的新型疫苗萬分迫切。
　　肝素結合血凝素（heparin-binding haemagglutinin,HBHA）是結核分枝桿菌重要的粘附蛋白，然而，關于HBHA在結核分枝桿菌中的毒力作用目前尚不明確。鑒于自噬在病原菌感染過程中發(fā)揮著十分重要的作用，本課題組利用Western blot、免疫熒光、siRNA和同源重組敲減BCG菌株中HBHA蛋白等技術，檢測H

3、BHA是否能夠調控巨噬細胞自噬， HBHA調控巨噬細胞自噬過程中通過什么分子機制來輔助MTB逃離免疫殺傷，是本課題的重點研究內容。
　　主要研究內容分為以下三個部分：
　　第一部分、HBHA抑制巨噬細胞自噬
　　HBHA（8μg/mL）與巨噬細胞共同孵育2 hours，Western blot檢測LC3Ⅱ、Beclin-1、mTOR的表達水平，結果顯示，HBHA能夠顯著抑制自噬標志物LC3Ⅱ、Beclin-1的表達，促

4、進mTOR表達；為了更直觀的觀測LC3變化情況，我們還運用免疫熒光檢測LC3，免疫熒光結果顯示LC3熒光顆粒顯著降低，表明HBHA能夠抑制LC3的生成；通過siRNA技術敲減Raw264.7細胞中NOD2和TLR4的表達水平，Western blot檢測LC3、P62變化情況，結果證明TLR4 siRNA組的細胞能夠有效阻斷HBHA抑制自噬這一過程，表明HBHA是通過調控TLR4的表達從而抑制巨噬細胞自噬；通過同源重組方法構建BCG::

5、HBHA敲除株和BCG野生株感染Raw264.7巨噬細胞，免疫熒光觀察LC3變化情況，結果顯示，BCG::HBHA敲除株不能有效抑制LC3表達。
　　第二部分、HBHA通過活化Caspase家族誘導巨噬細胞凋亡
　　流式細胞術Annexin V-FITC/PI檢測細胞總凋亡率，流式細胞檢測結果顯示，HBHA（10μg/mL）作用巨噬細胞24 hours/48 hours細胞總凋亡率顯著升高，為了驗證是HBHA純化蛋白促進的細

6、胞凋亡，而不是因為細胞培養(yǎng)時間過長，培養(yǎng)液營養(yǎng)不足造成的細胞凋亡，我們運用免疫熒光檢測HBHA純化蛋白何時進入巨噬細胞，并且，能夠在細胞中存在多長時間不降解，結果顯示，HBHA（4μg/mL）2 hours就有少量進入巨噬細胞，隨著時間延長，蛋白進入細胞增多，并能穩(wěn)定表達至72 hours；Western blot檢測Caspase-8/Caspase-3活化程度，在HBHA作用24/48 hours均有活化的Caspase-3/Cas

7、pase-8條帶出現(xiàn)，加入Caspase家族的抑制劑z-VAD-fmk后，未見活化Caspase-3/Caspase-8條帶，表明HBHA是通過活化Caspase家族促進巨噬細胞凋亡；Western blot檢測凋亡抑制基因bcl-2的表達，HBHA作用24 hours后能夠顯著抑制bcl-2的表達。
　　第三部分、HBHA誘導巨噬細胞M2極化
　　1. HBHA純化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細胞72 h

8、ours，通過ELISA的方法對細胞上清細胞因子進行檢測，結果顯示，IL-10的表達水平升高，而TNF-α表達水平降低，初步推斷HBHA在低濃度、長時間誘導巨噬細胞，能夠將Raw264.7巨噬細胞誘導成M2型巨噬細胞；HBHA純化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細胞72 hours，分別通過Western blot、免疫熒光、流式細胞技術檢測ARG-1、CD206、iNOS表達水平，結果顯示，ARG-1和CD206表達均升

9、高，表明巨噬細胞成功誘導成M2型，加入HBHA（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細胞72 hours，結果顯示，ARG-1和CD206表達升高，證明HBHA低濃度長時間可將巨噬細胞誘導成M2型巨噬細胞；HBHA純化蛋白以（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細胞72 hours檢測CUEDC2表達水平，并與未處理組巨噬細胞相比，HBHA（4μg/mL）作用Raw264.7巨噬細胞72 hours能夠促進CUEDC2表達。