1、目的：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染引起的嚴(yán)重的慢性傳染性疾病，世界上有三分之一的人口感染結(jié)核分枝桿菌，每年造成約兩百萬人死亡。近年來，隨著結(jié)核分枝桿菌的多重耐藥性菌株的出現(xiàn)及與艾滋病的共感染，結(jié)核病的控制難度不斷加大。為研發(fā)新型的疫苗及治療藥物，我們需要對結(jié)核病發(fā)病的分子機制做透徹的研究。MptpB是Mtb分泌的重要毒力因子。從結(jié)構(gòu)上看MptpB屬于酪氨酸磷酸酶，體外實驗顯示出對酪氨酸，絲氨酸/蘇氨酸及磷酸肌醇的磷酸酶活性，體內(nèi)

2、底物尚不清楚。MptpB缺失的Mtb感染豚鼠后細(xì)菌載量比野生型低越70倍，感染活化的巨噬細(xì)胞后細(xì)菌載量也比野生型低5到7倍，說明MptpB抑制了巨噬細(xì)胞殺傷Mtb的功能，是支持Mtb在體內(nèi)存活的重要毒力因子。本研究的目的是探查MptpB在巨噬細(xì)胞中的作用，并初步探討其作用機制。
　　方法：⑴克隆了MptpB基因，構(gòu)建了其真核載體，并建立了過表達(dá)MptpB的巨噬細(xì)胞系Raw-MptpB。為檢測過表達(dá)的MptpB對Mtb存活的影響，我

3、們用H37Rv感染了Raw-MptpB及對照細(xì)胞，并分別計數(shù)了細(xì)菌載量。結(jié)果表明，Raw-MptpB細(xì)胞在感染H37Rv2-6天后細(xì)菌載量比對照細(xì)胞高2-4倍。⑵為確定MptpB對巨噬細(xì)胞免疫功能的影響，我們在用IFN-γ，LPS及H37Rv刺激Raw-MptpB及對照細(xì)胞后，用real time PCR及ELISA檢測了多種細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MptpB抑制了IL-1β及IL-6在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)；我們同時用western blot測

4、定iNOS表達(dá)量，并檢測了其產(chǎn)物NO的含量，發(fā)現(xiàn)MptpB抑制了iNOS的表達(dá)并降低了 NO在培養(yǎng)液中的濃度；我們用被剪切的 caspase3的蛋白量,caspase3的活性及p53蛋白水平來檢測Raw-MptpB細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)MptpB抑制了IFN-γ及H37Rv誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。⑶為探討MptpB抑制巨噬細(xì)胞功能的機制，我們在用IFN-γ，LPS及H37Rv刺激Raw-MptpB及對照細(xì)胞后，檢測了STAT1，p65，Erk1/2，

5、p38，JNK等信號分子的磷酸化及蛋白量。
　　結(jié)果：MptpB能夠抑制p65和p38的磷酸化，從而抑制NF- B信號途徑。在細(xì)菌中表達(dá)了帶His標(biāo)簽的MptpB蛋白，與巨噬細(xì)胞裂解液共孵育后，用His Beads進(jìn)行免疫共沉淀。沉淀產(chǎn)物用SDS-PAGE膠分離，質(zhì)譜鑒定。根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果，我們克隆了可能的MptpB互作蛋白，構(gòu)建其真核表達(dá)載體，與MptpB真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染了293T細(xì)胞，進(jìn)行免疫共沉淀的驗證。驗證結(jié)果表明，Rv

6、b1/Rvb2是MptpB在巨噬細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白。
　　結(jié)論：在巨噬細(xì)胞中過表達(dá)MptpB能夠促進(jìn)H37Rv在巨噬細(xì)胞中的存活。MptpB抑制了iNOS的表達(dá)以減少NOS產(chǎn)物，抑制了巨噬細(xì)胞的凋亡，并抑制了促炎因子IL-1β及IL-6的表達(dá)，從而阻礙了巨噬細(xì)胞對Mtb的殺滅。MptpB通過抑制p65、p38及Erk1/2的磷酸化阻礙了NF-κB和MAPK信號通路，抑制了iNOS及炎性因子的表達(dá)。其機制可能與其相互作用蛋白Rvb