1、癲癇是一種臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其表現(xiàn)主要是由于大腦神經(jīng)元反復(fù)的異常放電導(dǎo)致腦功能暫時(shí)性失常。其原因復(fù)雜，最近幾年，研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作區(qū)域會(huì)出現(xiàn)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的升高，突觸功能改變等大腦結(jié)構(gòu)和功能的變化，這些變化又可以使得癲癇呈現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，是癲癇頻繁發(fā)作和難治的原因之一。谷氨酸受體功能異?？赡苁瞧湓蛑唬窠?jīng)肽Y(NPY)是由36個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，廣泛分布在周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要分布于丘腦、下丘

2、腦、海馬、大腦皮層等部位，而尤以海馬處密度最高(Ledri M et al.,2011)。近幾年研究顯示NPY是一個(gè)強(qiáng)有力的內(nèi)源性抗癲癇因子（Cardoso A et al.,2010），文獻(xiàn)報(bào)道NPY在神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)及抑制癲癇發(fā)作方面發(fā)揮著重要作用，但是至今 NPY抑制癲癇發(fā)作的機(jī)制仍不十分清楚(S?rensen AT et al.,2009)。過去對(duì)其作用機(jī)制的研究大部分局限于NPY對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，認(rèn)為NPY主要通過Y2和Y5

3、受體抑制突觸前膜N型鈣通道，使鈣內(nèi)流減少，導(dǎo)致興奮性性遞質(zhì)谷氨酸釋放減少，從而抑制突觸后膜的興奮性傳遞，發(fā)揮抑制癲癇發(fā)作的作用(Silva AP et al.,2007)，至于其如何引起鈣通道變化的中間環(huán)節(jié)及是否存在其他機(jī)制來發(fā)揮其抗癲癇作用，目前研究甚少。谷氨酸受體功能的變化可以導(dǎo)致體內(nèi)興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡，誘發(fā)癲癇的發(fā)作及造成神經(jīng)元損傷，α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸（AMPA）受體是離子型谷氨酸三大受體之一，是除

4、NMDA受體外另一類重要的興奮性氨基酸特異性受體,它主要介導(dǎo)快速的興奮性遞質(zhì)傳遞(Savtchouk I et al.,2011)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，他的過度激活可以提高神經(jīng)元興奮性，在癲癇的發(fā)病中起著重要作用（Yue Hu et al.,2012）。
　　我們推測(cè)NPY是否有可能通過調(diào)節(jié)AMPA受體的功能，抑制癲癇發(fā)作的作用？本實(shí)驗(yàn)選用大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型，采用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)NPY對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元癲癇樣放電的影響，

5、檢測(cè)NPY對(duì)細(xì)胞癲癇樣放電狀態(tài)下的AMPA電流的影響，檢測(cè)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電狀態(tài)下的AMPA受體Glu2亞單位mRNA及總蛋白和蛋白磷酸化變化，以及NPY對(duì)其的影響，并檢測(cè)NPY對(duì)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后的相關(guān)凋亡指標(biāo)的檢測(cè)，最后通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NPY是否作用于海馬神經(jīng)元AMPA受體抑制動(dòng)物癲癇發(fā)作，探討NPY通過調(diào)節(jié)AMPA受體的生物活性、減弱興奮性神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)神經(jīng)元的損害和抗癲癇發(fā)作的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)共分四部分。
　　第一部分：神經(jīng)

6、肽Y對(duì)癲癇樣放電狀態(tài)海馬神經(jīng)元AMPA電流的影響
　　目的：以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，用無鎂(Mg2+free)細(xì)胞外液處理3h，然后用正常細(xì)胞外液繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)而進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)，比較海馬神經(jīng)元癲癇樣放電狀態(tài)下神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元AMPA電流的影響，探討神經(jīng)肽Y對(duì)AMPA受體功能的影響及其作用機(jī)理。
　　方法：采用24h新生SD大鼠，取海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，體外培養(yǎng)至第12d時(shí)，將海馬神經(jīng)元分為Contro

7、l組、模型組(Mg2+free組)，NPY(1μM)干預(yù)組，BIBP3226+NPY干預(yù)組。Control組換正常細(xì)胞外液處理3h，模型組只用無鎂細(xì)胞外液處理3h，NPY組細(xì)胞是先以含NPY(濃度為1μmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，然后用無鎂細(xì)胞外液處理3h。BIBP3226+NPY干預(yù)組細(xì)胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226（終濃度為1μmol/L)的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0

8、.5h，最后加入無鎂細(xì)胞外液處理3h。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)Control組、模型組(Mg2+free組)和NPY(1μM)干預(yù)組的動(dòng)作電位，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)Control組、模型組(Mg2+free組)和NPY(1μM)干預(yù)組和BIBP3226+NPY干預(yù)組神經(jīng)元的AMPA電流（IAMPA），計(jì)算峰值電流密度。
　　結(jié)果：膜片鉗實(shí)驗(yàn)顯示模型組細(xì)胞出現(xiàn)穩(wěn)定的異常動(dòng)作電位，動(dòng)作電位的頻率和幅度明顯高于Control組，NPY(1μ

9、M)干預(yù)組動(dòng)作電位的頻率和幅度都顯著低于模型組（P＜0.05）。模型組神經(jīng)元IAMPA峰值密度較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），NPY(1μM)干預(yù)組IAMPA峰值電流密度較模型組顯著升高（P＜0.05），BIBP3226+NPY干預(yù)組的神經(jīng)元IAMPA峰值電流密度較NPY干預(yù)組顯著下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：模型組細(xì)胞在"無鎂細(xì)胞外液”處理3h后，細(xì)胞出現(xiàn)異常動(dòng)作電位，可以模擬細(xì)胞癲癇樣放電，NPY預(yù)處理海馬神經(jīng)元可以抑制

10、這種放電。海馬神經(jīng)元癲癇樣放電可以出現(xiàn)神經(jīng)元的IAMPA下降，NPY可以減輕癲癇樣放電對(duì)神經(jīng)元IAMPA的抑制，避免神經(jīng)元IAMPA的過度下降，NPY有可能通過調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的AMPA受體功能，發(fā)揮抗癲癇作用。提前加入NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226后，NPY的作用被抑制，提示NPY可能是通過激活Y1受體發(fā)揮對(duì)AMPA受體功能的調(diào)節(jié)。
　　第二部分：神經(jīng)肽Y對(duì)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電狀態(tài)AMPA受體GluR2亞單位的影響

11、　　目的：以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象，用無鎂(Mg2+free)細(xì)胞外液處理3h制作海馬神經(jīng)元癲癇樣放電模型，利用RT-PCR及Western blot法檢測(cè)海馬神經(jīng)元癲癇樣放電對(duì)AMPA受體GluR2亞單位功能的影響，以及神經(jīng)肽Y（NPY）對(duì)癲癇樣放電海馬神經(jīng)元AMPA受體GluR2功能的影響。
　　方法：采用24h內(nèi)新生SD大鼠，取海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，體外培養(yǎng)至第12d時(shí)，隨機(jī)分為Control組、模型組(Mg2

12、+free組)，NPY干預(yù)組和BIBP3226+NPY干預(yù)組，Control組換正常細(xì)胞外液處理3h，模型組只用無鎂細(xì)胞外液處理3h，NPY組是先以含NPY的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，然后用無鎂細(xì)胞外液處理3h，BIBP3226+NPY干預(yù)組先用含BIBP3226的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入無鎂細(xì)胞外液處理3h，所有各組恢復(fù)正常細(xì)胞外液培養(yǎng)1h。用免疫熒光測(cè)定海馬神經(jīng)元Control

13、組、模型組(Mg2+free組)，NPY干預(yù)組的AMPA受體GluR2亞單位表達(dá)。應(yīng)用RT-PCR法及Western blot法檢測(cè)Control組、模型組(Mg2+free組)，NPY干預(yù)組和BIBP3226+NPY干預(yù)組中海馬神經(jīng)元的GluR2mRNA表達(dá)水平及GluR2亞單位的總蛋白和磷酸化變化。
　　結(jié)果：免疫熒光染色顯示Control組神經(jīng)元外觀正常，細(xì)胞軸突表達(dá)GluR2明顯，模型組神經(jīng)元GluR2熒光表達(dá)明顯下降，N

14、PY組神經(jīng)元GluR2的表達(dá)較模型組有所增強(qiáng)。RT-PCR檢測(cè)顯示模型組GluR2mRNA較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05），NPY干預(yù)組GluR2mRNA較模型組顯著上升（P＜0.05），BIBP3226+NPY干預(yù)組GluR2mRNA較NPY組顯著下降（P＜0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示模型組GluR2亞單位的蛋白含量較對(duì)照組輕微下降，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型組GluR2亞單位的磷酸化水平較對(duì)照組顯著升高（

15、P＜0.05），NPY(1μm)干預(yù)組GluR2亞單位的磷酸化水平較模型組顯著下降（P＜0.05），BIBP3226+NPY干預(yù)組的GluR2亞單位的磷酸化水平較NPY組顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：海馬神經(jīng)元在無鎂細(xì)胞外液孵育3h后可以出現(xiàn)AMPA受體GluR2亞單位蛋白磷酸化增加、而未出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量的明顯變化， GluR2 mRNA的復(fù)制受抑制，說明海馬神經(jīng)元癲癇樣放電引起AMPA受體功能抑制的原因可能是由于Gl

16、uR2基因復(fù)制受抑制，蛋白出現(xiàn)磷酸化改變，以至神經(jīng)元突觸表面含正常GluR2亞單位的AMPA受體減少、功能改變。神經(jīng)肽Y可以抑制海馬神經(jīng)元癲癇樣放電對(duì)AMPA受體GluR2亞單位功能的過度抑制，這可能是其抑制癲癇的機(jī)制之一。應(yīng)用神經(jīng)肽Y的Y1受體阻斷劑可以抑制神經(jīng)肽Y這一作用，提示神經(jīng)肽Y可能是通過與海馬神經(jīng)元上的Y1受體作用，來調(diào)節(jié)AMPA受體GluR2功能。
　　第三部分：神經(jīng)肽Y通過影響AMPA受體減輕海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后

17、神經(jīng)元凋亡
　　目的：以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象，研究海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后是否會(huì)出現(xiàn)凋亡及神經(jīng)肽Y是否可以通過影響海馬神經(jīng)元AMPA受體抑制凋亡的發(fā)生。
　　方法：采用24h內(nèi)新生SD大鼠，取海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)，體外培養(yǎng)至第12d時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為Control組、模型組(Mg2+free組)，NPY干預(yù)組和CNQX+NPY干預(yù)組，Control組換正常細(xì)胞外液處理3h，模型組只用無鎂細(xì)胞外液處理3h，NPY

18、組是先以含NPY的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，然后用無鎂細(xì)胞外液處理3h，CNQX+NPY干預(yù)組預(yù)先用含CNQX的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入無鎂細(xì)胞外液處理3h。各組細(xì)胞恢復(fù)正常細(xì)胞培養(yǎng)液12小時(shí)，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞的Caspase-3蛋白的表達(dá)，應(yīng)用 RT-PCR法檢測(cè)各組神經(jīng)元細(xì)胞Caspase-3mRNA水

19、平。
　　結(jié)果：TUNEL法檢測(cè)顯示模型組較Control組海馬神經(jīng)元陽性神經(jīng)元明顯增加（P＜0.05），NPY干預(yù)組陽性神經(jīng)元明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)顯示模型組Caspase-3的蛋白含量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），RT-PCR法檢測(cè)顯示Caspase-3mRNA較對(duì)照組也顯著升高（P＜0.05），兩者變化一致。NPY干預(yù)組Caspase-3的蛋白水平較模型組顯著下降（

20、P＜0.05），Caspase-3mRNA較模型組顯著下降（P＜0.05）。CNQX+NPY干預(yù)組的Caspase-3蛋白水平較NPY組顯著升高（P＜0.05），Caspase-3mRNA較NPY組顯著升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：海馬神經(jīng)元癲癇樣放電后可以出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡，這與動(dòng)物急性癲癇模型的表現(xiàn)是一致的。神經(jīng)肽Y可以抑制這種癲癇樣放電引起的神經(jīng)元凋亡，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用，應(yīng)用AMPA受體阻斷劑CNQX后，神經(jīng)肽Y的這一作用

21、被抑制，提示神經(jīng)肽Y可能是通過影響海馬神經(jīng)元AMPA受體的功能來發(fā)揮抗凋亡保護(hù)神經(jīng)元的作用。
　　第四部分：神經(jīng)肽Y對(duì)大鼠急性癲癇發(fā)作后GluR2亞單位的影響及行為學(xué)改變
　　目的：以SD大鼠為研究對(duì)象，通過觀察經(jīng)過海馬CA3區(qū)分別注射神經(jīng)肽Y和BIBP3226+神經(jīng)肽Y后，側(cè)腦室注射海人酸誘發(fā)大鼠急性癲癇發(fā)作，研究大鼠的行為學(xué)變化及海馬CA3區(qū)的GluR2亞單位功能變化，探討神經(jīng)肽Y以海馬神經(jīng)元AMPA受體GluR2亞單位

22、為靶點(diǎn)對(duì)大鼠癲癇發(fā)作的影響。
　　方法：將SD大鼠分為Control組、模型組（海人酸致癇組）、NPY干預(yù)組、BIBP3226+NPY干預(yù)組，每組10只。各組動(dòng)物采用立體定向微量注射相應(yīng)藥物，觀察各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。根據(jù)Racine的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠癲癇發(fā)作程度進(jìn)行評(píng)估，以Ⅰ-Ⅱ級(jí)為輕度發(fā)作，Ⅲ級(jí)以上為重度發(fā)作。腦室注射后12小時(shí)，每組取5只大鼠用Western blot法檢測(cè)各組動(dòng)物海馬CA3區(qū)的GluR2亞單位的總蛋白變化和磷

23、酸化變化，RT-PCR方法檢測(cè)各組動(dòng)物海馬CA3區(qū)的GluR2mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：20分鐘內(nèi)，模型組大鼠出現(xiàn)癲癇重度發(fā)作，NPY干預(yù)組出現(xiàn)輕度發(fā)作，BIBP3226+NPY干預(yù)組的癲癇發(fā)作水平較NPY組顯著升高（P＜0.05），Control組未見癲癇發(fā)作。腦室注射后12小時(shí)，模型組GluR2亞單位的蛋白含量與對(duì)照組性比無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05)，GluR2亞單位的磷酸化水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05），GluR2

24、mRNA較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）。NPY干預(yù)組GluR2亞單位的磷酸化水平較模型組顯著下降（P＜0.05），GluR2mRNA較模型組顯著上升（P＜0.05）。BIBP3226+NPY干預(yù)組的GluR2亞單位的磷酸化水平較NPY組顯著升高（P＜0.05）， GluR2mRNA較NPY組顯著下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論：腦室內(nèi)注射海人酸可以誘發(fā)癲癇發(fā)作，可以引起海馬AMPA受體GluR2亞單位表達(dá)受抑制，NPY可以抑制癲