1、癲癇是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，主要特征是由大腦神經(jīng)元反復(fù)異常放電導(dǎo)致的暫時(shí)性腦功能失常。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作區(qū)域會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生，突觸重建等大腦結(jié)構(gòu)和功能的可塑性變化，而這些可塑性變化又使得癲癇呈現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，是癲癇頻繁發(fā)作和難治的主要原因之一。以往的研究認(rèn)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中僅僅起到支持、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)作用，隨著對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中所起作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在包括癲癇在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中

2、起著重要作用。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元細(xì)胞以外的另一大類細(xì)胞，其數(shù)量為神經(jīng)元細(xì)胞的(10～50)倍。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要有星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。正常狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可在細(xì)胞內(nèi)將具有神經(jīng)毒性的谷氨酸轉(zhuǎn)變成無(wú)毒性的谷氨酰胺，對(duì)大腦起到保護(hù)作用。星形膠質(zhì)胞還可通過(guò)對(duì)鉀的緩沖作用維持神經(jīng)元周圍內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是維持神經(jīng)元正常興奮性的基礎(chǔ)。研究表明，癲癇發(fā)生區(qū)域的

3、星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取和滅活能力降低，谷氨酰胺合成減少，對(duì)鉀的緩沖作用減弱，這可能是導(dǎo)致該區(qū)域神經(jīng)元的興奮性增高，誘發(fā)癲癇的反復(fù)發(fā)作的原因之一。小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性激活及隨后發(fā)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)難治性癲癇的發(fā)生有重要意義。其對(duì)神經(jīng)元的影響途徑可能包括:1.不斷激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌活性物質(zhì)，誘發(fā)興奮性氨基酸的釋放，增加神經(jīng)元興奮性。2.早期激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)等抗炎細(xì)胞因子，

4、其中TGF-β具有明確的神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡作用，表明在反應(yīng)初期小膠質(zhì)細(xì)胞可能通過(guò)分泌有修復(fù)損傷能力的生長(zhǎng)因子起到保護(hù)神經(jīng)元作用。3.小膠質(zhì)細(xì)胞聚集增生可形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)，參與神經(jīng)損傷時(shí)瘢痕組織的形成。4.小膠質(zhì)細(xì)胞持續(xù)活化可以誘發(fā)強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生和釋放IL-1β和TNF-α等大量炎癥因子，提高神經(jīng)元NMDA受體表達(dá)，增加其活性，誘發(fā)癲癇的發(fā)生。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活后產(chǎn)生的NO等生物活性物質(zhì)也可以加重NMDA引起的神經(jīng)毒性。發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，小膠質(zhì)

5、細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和氧自由基等炎癥介質(zhì)可以損傷血腦屏障，使血腦屏障通透性增加，對(duì)腦組織的保護(hù)作用減弱，腦組織易受損傷。
　　炎癥是機(jī)體對(duì)損傷的一種防御反應(yīng)，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體組織損傷。癲癇的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，加重癲癇。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，是產(chǎn)生炎癥因子的主要細(xì)胞之一。小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活及隨后產(chǎn)生的大量炎癥因子可能是導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作的因素之一，通過(guò)抑制小

6、膠質(zhì)細(xì)胞的生物活性，減少某些炎癥因子的產(chǎn)生可能是治療癲癇的一種新的途徑。
　　神經(jīng)肽Y(NPY)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元受到損傷時(shí)發(fā)揮著保護(hù)作用。過(guò)去對(duì)其作用機(jī)制的研究大部分局限于NPY對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，認(rèn)為NPY主要通過(guò)Y2和Y5受體起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。最近有研究顯示，NPY可以抑制LPS所致的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞N9細(xì)胞株的激活，降低N9細(xì)胞株的免疫活性，抑制其遷移和吞噬能力以及IL-1β及NO的生成。我們

7、推測(cè)NPY有可能通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子的釋放來(lái)達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元、抑制癲癇發(fā)作的作用。本實(shí)驗(yàn)采用Elisa法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)NPY對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生成IL-1β和TNF-α的影響，用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)NPY以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元NMDA電流的影響，以及NPY通過(guò)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而對(duì)動(dòng)物癲癇發(fā)作的行為學(xué)影響，探討NPY通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞生物活性、減弱炎癥反應(yīng)起到保護(hù)神經(jīng)元和抗癲癇發(fā)作的作用及其機(jī)制

8、，尋找以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)的治療癲癇的新途徑。本實(shí)驗(yàn)共分四部分。
　　第一部分、LPS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生成IL-1β、TNF-a的影響
　　目的:以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，比較LPS處理小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)間與小膠質(zhì)細(xì)胞生成IL-1β和TNF-α的時(shí)效關(guān)系，尋找能夠使小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-1β、TNF-a的LPS最佳干預(yù)時(shí)間，為下一步的實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　方法:培養(yǎng)原代大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為10組，5組為L(zhǎng)P

9、S處理組，以含LPS（終濃度為100ng/ml）的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液分別孵育1h、3h、6h、12h、24h。每個(gè)LPS處理組均設(shè)平行對(duì)照，對(duì)照組共5組，用無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育，孵育時(shí)間同LPS處理組。孵育結(jié)束后，Elisa方法檢測(cè)培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:以含LPS的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育原代小膠質(zhì)細(xì)胞1h、3h、6

10、h、12h，24h后，各組培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比均有顯著性增高(P＜0.05); LPS處理組培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量及小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1βmRNA和TNF-αmRNA表達(dá)水平隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，IL-1β在3小時(shí)達(dá)到高峰，TNF-α在6小時(shí)達(dá)到高峰，二者在6小時(shí)均處于較高水平，以后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸所下降，相鄰LPS處理組間均有顯

11、著性差異。
　　結(jié)論:LPS能夠刺激小膠質(zhì)細(xì)胞大量產(chǎn)生IL-1β和TNF-α，這種效應(yīng)與LPS刺激時(shí)間相關(guān)，在刺激6小時(shí)時(shí)IL-1β和TNF-α均處于較高水平。
　　第二部分、NPY對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生成TNF-α、IL-1β的影響及其作用機(jī)制
　　目的:以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，比較NPY處理后小膠質(zhì)細(xì)胞生成TNF-α、IL-1β的變化，探討NPY對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生成TNF-α、IL-1β的抑制作用及其作用機(jī)理

12、。
　　方法:將培養(yǎng)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞分為Control組、LPS組、NPY+LPS組、NPY組和BIBP3226+NPY+LPS組。Control組細(xì)胞以無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育6h，LPS組細(xì)胞以含終濃度為100ng/mL LPS的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育6h，NPY+LPS組細(xì)胞是先以含NPY(終濃度為1μmol/L)的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，然后加入LPS（終濃度為100ng/mL）繼續(xù)孵育6h。NPY組細(xì)胞是以含

13、NPY(終濃度為1μmol/L)無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育細(xì)胞6h。BIBP3226+NPY+LPS組細(xì)胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226(終濃度為1μmol/L)的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入終濃度為100ng/mL的LPS繼續(xù)孵育6h。Elisa方法檢測(cè)培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α蛋白含量，RT-PCR方法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞中IL-1βmRNA和 TNF-αmR

14、NA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:孵育各組小膠質(zhì)細(xì)胞6小時(shí)后，LPS組培養(yǎng)液中IL-1β、TNF-a的含量及細(xì)胞中IL-1βmRNA、TNF-αmRNA表達(dá)水平顯著高于Control組(P＜0.05); LPS+NPY組與LPS組相比，IL-1β、TNF-a蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)，IBP3226+NPY+LPS組與LPS+NPY組相比，IL-1β、TNF-a蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)，LPS組和

15、IBP3226+NPY+LPS組之間無(wú)顯著性差異。NPY組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明NPY明顯降低了小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源地TNF-a和IL-1β的產(chǎn)生，這種效應(yīng)可以被BIBP3226阻斷，NPY對(duì)未活化的小膠質(zhì)細(xì)胞生沒(méi)有明顯影響。
　　結(jié)論:NPY通過(guò)作用于NPYY1受體降低小膠質(zhì)細(xì)胞的生物活性，抑制其生成TNF-a和IL-1β。
　　第三部分、NPY通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫活性影響神經(jīng)元NMDA電流
　　目的:以原代培養(yǎng)的

16、大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞為研究對(duì)象，用LPS和NPY處理后的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育神經(jīng)元細(xì)胞，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)元NMDA電流的變化，探討NPY通過(guò)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫活性的調(diào)節(jié)影響神經(jīng)元NMDA電流及其可能的作用機(jī)制。
　　方法:將培養(yǎng)好的原代小膠質(zhì)細(xì)胞分為Control組、LPS組、NPY+LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組。Control組細(xì)胞以無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育6h，LPS組細(xì)胞以含終濃度為100ng/

17、mL LPS的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育6h，NPY+LPS組細(xì)胞是先以含NPY(終濃度為1μmol/L)的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，然后加入LPS（終濃度為100ng/mL）繼續(xù)孵育6h。BIBP3226+NPY+LPS組細(xì)胞先用含NPY Y1受體阻斷劑BIBP3226（終濃度為1μmol/L）的無(wú)血清膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液孵育0.5h，再加入終濃度為1μmol/L的NPY孵育0.5h，最后加入終濃度100ng/mL的LPS繼續(xù)孵育6h

18、。6小時(shí)后，將Control組、LPS組、NPY+LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液與神經(jīng)元培養(yǎng)液1∶1混合。培養(yǎng)好的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分為Control組、LPS組、NPY+LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組，每組3個(gè)樣本。用上述混合培養(yǎng)液孵育相應(yīng)組別的神經(jīng)元6小時(shí)。用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)孵育好的各組神經(jīng)元細(xì)胞的NMDA電流(INMDA)，計(jì)算電流密度。
　　結(jié)果:膜片鉗檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相

19、比，LPS組神經(jīng)元NMDA電流密度顯著增加(P＜0.05)，而加入NPY后(NPY+LPS組)豐申經(jīng)元的NMDA電流密度顯著降低(P＜0.05)，再加入BIBP3226后（BIBP3226+NPY+LPS組）神經(jīng)元的NMDA電流密度顯著上升(P＜0.05)，LPS組與BIBP3226+NPY+LPS組無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論:激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞可以使神經(jīng)元的INMDA增高。NPY通過(guò)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞NPY Y1受體，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)

20、神經(jīng)元INMDA的影響，避免神經(jīng)元INMDA的過(guò)度增高。這種作用是通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間的非直接接觸途徑實(shí)現(xiàn)的，可能與小膠質(zhì)細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的TNF-a和IL-1β等生物活性物質(zhì)有關(guān)。
　　第四部分、NPY通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)免疫途徑對(duì)大鼠癲癇發(fā)作行為學(xué)的影響
　　目的:以SD大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)觀察經(jīng)過(guò)LPS和NPY處理后不同組別的小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液注入大鼠側(cè)腦室后行為學(xué)的表現(xiàn)，探討NPY以中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞

21、為靶點(diǎn)對(duì)大鼠癲癇發(fā)作的影響。
　　方法:將SD大鼠隨機(jī)分為Control組、LPS組、NPY+LPS組、BIBP3226+NPY+LPS組，每組5只。采用第一部分同樣方法培養(yǎng)和純化原代大鼠皮層小膠質(zhì)細(xì)胞。采用第三部分方法分組及處理小膠質(zhì)細(xì)胞。將各組小膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液離心后注入相應(yīng)各組大鼠的側(cè)腦室。觀察各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。根據(jù)Diehl的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠癲癇發(fā)作程度進(jìn)行評(píng)估，以Ⅰ-Ⅱ級(jí)為輕度發(fā)作，Ⅲ-Ⅳ級(jí)重度發(fā)作。
　　結(jié)果

22、:20分鐘內(nèi)，LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組5只大鼠均出現(xiàn)重度癲癇發(fā)作，NPY+LPS組有4只出現(xiàn)輕度癲癇發(fā)作，Control組未見癲癇發(fā)作.LPS組發(fā)作程度顯著高于對(duì)照組，NPY+LPS組發(fā)作程度顯著低于LPS組，BIBP3226+NPY+LPS組發(fā)作程度顯著高于NPY+LPS組。LPS組和BIBP3226+NPY+LPS組發(fā)作程度無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞可以導(dǎo)致大鼠癲癇發(fā)作，這種作用是通過(guò)小膠質(zhì)