1、木糖是自然界第二豐富的碳水化合物(僅次于葡萄糖)。要有效利用木糖就要通過生物轉化法，既微生物或者酶的催化將原料轉化為更有附加價值的產(chǎn)物。許多微生物都能夠將木糖作為一種碳源來利用。但是只有一小部分能夠發(fā)酵木糖，并且副產(chǎn)物多，對高濃度代謝產(chǎn)物的耐受性差，都不利于進行大規(guī)模發(fā)酵。因此通過代謝工程獲得更好的能夠發(fā)酵木糖的工程菌是非常有吸引力的一條途徑。例如能夠發(fā)酵木糖的酵母工程菌，因為酵母更加適合大規(guī)模的發(fā)酵。天然酵母同化木糖的關鍵是木糖還原酶

2、(EC 1.1.1.21)，它在輔酶NADH或NADPH存在的情況下能夠將D-木糖還原成木糖醇。大部分木糖還原酶特異依賴NADPH，有一些則是需要利用NADH和NADPH，此外還有一些是偏好NADH的。盡管木糖還原酶不同的輔酶偏好性會影響木糖代謝工程菌的代謝流向，使其偏向于木糖醇積累或乙醇產(chǎn)生。但是想要通過基因改造獲得能夠更好的利用木糖的酵母工程菌，首先就要獲得木糖轉化率高的木糖還原酶，然后根據(jù)其輔酶的偏好性構建木糖代謝工程菌。在本實驗

3、室前期通過比較現(xiàn)有的一些酵母菌木糖醇發(fā)酵情況，已篩選出一株發(fā)酵純木糖時木糖醇得率為47.30[％]，在優(yōu)化發(fā)酵條件后得率70.91[％]的高產(chǎn)出發(fā)菌株熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)AY92045的基礎上，進一步研究取得如下成果： 1．C. tropicalis AY92045木糖還原酶酶活初步測定。通過比色法測定C．tropicalis AY92045木糖還原酶粗提液的比酶活，發(fā)現(xiàn)它能夠利用2種輔酶，且

4、NADH：NADPH活力比為0.715。而已報道來源于C.tropicalis IFO 0618的木糖還原酶只能利用NADPH為輔酶。為了確定該酶的輔酶偏好性，為下一步構建木糖代謝工程菌奠定基礎，本試驗從基因和蛋白水平上對其做進一步研究。 2．C. tropicalis XYLl基因的克隆及序列分析。根據(jù)已報道序列克隆了C tropicalisAY92045中XYLl基因，其大小為975bp。通過生物信息學分析，

5、克隆所得XYLl基因與已報道的來源于C.tropicalis IFO 0618的木糖還原酶基因XYRA和XYRB的同源性相似性分別為98.5％和98.1％。其中XYRA與XYRB中的Pro4，Thr5，Ile6和Glu70分別被Val，Asn，Thr和Asp所代替。此外XYLl中的Thr29和Ala31與XYRA中的相同，而Ser249則與XYRB中的相同。 3．C. tropicalisXYLl基因在大腸桿菌中的表達及蛋白

6、純化。為了更好的研究C．tropicalis AY92045木糖還原酶的功能以及驗證其是否真的能夠利用NADH，將克隆得到的木糖還原酶基因ORF片段插入到大腸桿菌表達載體pET-32a中，構建成重組質粒pET32a—XYLl并轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中。通過不同IPTG濃度，不同誘導時間和不同誘導溫度進行小量表達，得到最優(yōu)表達條件為：終濃度為0.3mmol/L的IPTG，37℃搖床培養(yǎng)4h。高效表達后，通過Ni親和層析柱純化出大

7、量融合蛋白，其大小為57.5kDa。在酶切并再次純化后，SDS-PAGE結果顯示出一條帶，重組木糖還原酶的比酶活為109.7μmol/min·mg。 4．C.tropicalls重組木糖還原酶酶動力學測定及分析。分別測定了純化出的重組木糖還原酶的各項動力學參數(shù)，并研究其基本性質。該酶的最適pH在5.5左右，最適溫度在40-50℃之間，其最佳底物是五碳糖。能夠利用NADPH和NADH，但更偏好于NADPH,其KmNADPH為4

8、5.5μmol/L， VmaxNADPH為322.58μpmol/min·mg-protein；KmNADH為161.9μmol/L，VmaxNADH1.54μmol/min·mg-protein。通過對正向酶活和逆向酶活的測定發(fā)現(xiàn)它對木糖的催化效率相當高，且專一性好Kcat為14.4×10<'3>/min，Kcat/Km為457(mmol/L)/min；KmNADP<'+>為97μmol/L， Vmax為0.18μmol/min·mg