1、研究背景:乳腺癌是女性最常見的惡性、高度異質(zhì)性腫瘤之一。根據(jù)2011年 St.Gallen國際會議共識，乳腺癌被分為腔管A型、腔管B型、HER2過表達型和基底樣型乳腺癌(BLBC)。BLBC因ER陰性、PgR陰性、HER2陰性，屬于三陰性乳腺癌（TNBC）范疇，在臨床不能應用內(nèi)分泌治療，且抗HER2治療無效，主要治療手段是化療，因此尋找有效針對三陰性乳腺癌的治療靶點，對乳腺癌進行個體化治療是目前臨床研究乳腺癌的重要方向。
　　上皮

2、-間質(zhì)轉化(EMT)是使具有極性的上皮細胞經(jīng)過多個生物化學改變，獲得間質(zhì)細胞表型的生物學過程。從啟動至完成EMT涉及多個分子生物過程，如轉錄因子的激活、細胞骨架蛋白的重組和表達、細胞外基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生以及特定miRNA的表達等。上述分子生物學的改變將導致細胞內(nèi)與細胞間的特征發(fā)生一系列變化，主要表現(xiàn)為上皮細胞失去極性，與上皮細胞相互作用的基底膜降解，間質(zhì)樣細胞形成并從其起源的上皮層遷移。正常情況下，EMT是機體胚胎發(fā)育以及機體修復受傷組織

3、的重要調(diào)控機制，病理情況下，EMT則是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。
　　Snail-2（Slug）是EMT的重要轉錄因子之一，可通過多種途徑調(diào)節(jié)EMT。E-cadherin是一種細胞粘附分子，可阻止細胞移動、侵襲和轉移，抑制 EMT的發(fā)生，E-cadherin丟失是EMT發(fā)生的最主要特征。已經(jīng)證實，Slug可通過結合E-cadherin基因啟動子的E盒而直接抑制其表達，進而導致EMT的發(fā)生。

4、>　　miRNA是一類長約22-25nt的非編碼 RNA，可與 mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）結合，負向調(diào)控 mRNA。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429，均可抑制EMT，降低癌細胞轉移能力，屬于腫瘤抑制性miRNA。miR-200c可通過靶向結合ZEB1、ZEB2、HMGB1和Pin1等因子調(diào)節(jié)乳腺癌細胞EMT過程，表明miR-200c在調(diào)節(jié)乳腺癌浸潤、侵襲

5、、轉移中發(fā)揮重要作用，是目前研究乳腺癌EMT的熱點。
　　Liu、Fu等分別在人前列腺癌細胞系和惡性膠母質(zhì)瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，miR-200c可通過靶向下調(diào) Slug進而抑制 EMT過程。本課題組前期通過基因分析預測miR-200c可以與Slug結合，并以三陰性BT549細胞為研究對象，通過RT-PCR和Western Blot等技術檢測Slug和E-cadherin在mRNA及蛋白水平的表達情況，采用侵襲實驗和劃痕實驗檢測BT549轉

6、染miR-200c后侵襲、遷移能力的變化情況，表明miR-200c在BT549中可通過抑制Slug的表達進而提升E-cadherin的表達，抑制細胞遷移。而2015年St Gallen早期乳腺癌國際專家共識指出，三陰性乳腺癌之間仍存在較大異質(zhì)性，部分三陰性乳腺癌對化療敏感，預后較好；另一部分則對同樣的化療方案高度耐藥。至本研究開題時，僅有本課題組前期對三陰性細胞系BT549轉染miR-200c用于研究Slug調(diào)控EMT機制的報道，由于乳

7、腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，在其它乳腺癌細胞系中miR-200c是否通過上述途徑調(diào)控EMT尚未見報道。
　　目的:本研究選用三陰性細胞系（BT549、MDA-MB-231）和非三陰性細胞系（腔管 A型的MCF-7、HER2過表達型的SK-BR-3），對兩組細胞系轉染 miR-200c模擬物及其陰性對照物，檢測Slug和E-cadherin在mRNA、蛋白水平的表達變化情況，觀察 miR-200c對三陰性細胞系遷移能力的影響情況，探討

8、 miR-200c對三陰性乳腺癌EMT的調(diào)節(jié)作用，以期為臨床診治三陰性乳腺癌提供新的靶標。
　　材料和方法:
　　1.研究對象和分組:選擇三陰性乳腺癌細胞系BT549和MDA-MB-231，腔管A型乳腺癌細胞系MCF-7，HER2過表達型SK-BR-3為研究對象。所有細胞均用RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各細胞系按轉染物質(zhì)不同分為：miR-200c模擬物/Lipo2000組（A組）、miR-

9、200c陰性對照物/Lipo2000組（B組）、miRNA陰性對照物/Lipo2000組（C組），終濃度均為50 nM，同時設置轉染等量Lipo2000的組別為試劑對照組（D組），未處理組為空白對照組（E組）。
　　2.實驗方法
　　2.1細胞培養(yǎng)及轉染四個細胞系均用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2濕潤環(huán)境。在細胞處于對數(shù)期時，將細胞按一定數(shù)量接種于六孔板，常規(guī)培養(yǎng)24h后，對每個細胞系按分組不

10、同，在六孔板中分別轉染不同物質(zhì)后進行培養(yǎng)，待細胞鋪孔底95%以上時，進行后續(xù)操作。
　　2.2總RNA提取以及RT-PCR提取各組細胞的總RNA，反轉錄為cDNA。設計并合成 GAPDH、Slug和E-cadherin基因的上、下游引物，檢測各組細胞轉染miR-200c模擬物及其陰性對照物后Slug和E-cadherin在mRNA水平的表達情況。2.3總蛋白提取以及 Western Blot提取各組細胞的總蛋白，用以檢測各組細胞轉

11、染miR-200c模擬物及其陰性對照后Slug和E-cadherin在蛋白水平的表達情況。2.4劃痕實驗將BT549和MDA-MB-231均勻接種于六孔板中，培養(yǎng)約24 h后，對細胞進行轉染處理，更換不含抗體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)約36-48 h后，用高壓滅菌的200μl槍頭對各組細胞劃平行直線，用以檢測miR-200c對三陰性乳腺癌細胞系遷移能力的影響。
　　3.統(tǒng)計學分析:應用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。對于計量資料，用x±s

12、表示，各株細胞系間比較和細胞系內(nèi)各處理組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α＝0.05。
　　結果:
　　1.細胞選擇:選擇每個細胞系對數(shù)期的細胞進行消化，并接種于六孔板。根據(jù)實驗設計，對BT549和MDA-MB-231，選用1×105/孔的濃度將細胞接種于六孔板以進行后續(xù)試驗；對MCF-7和SK-BR-3，則選用3×105/孔的濃度
　　2.空白對照組Slug、E-cadherin的mRN

13、A和蛋白表達量:三陰性細胞系與非三陰性細胞系相比，空白對照組Slug、E-cadherin在mRNA與蛋白水平的表達量差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.miR-200c對兩組細胞系Slug、E-cadherin的影響:轉染miR-200c后，三陰性細胞系Slug在mRNA和蛋白水平表達量均明顯降低，E-cadherin在mRNA和蛋白水平表達量均明顯增高。
　　4.miR-200c對三陰性乳腺癌細胞遷移能力的影響:轉染 miR-