1、研究目的和背景：Men1基因是多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤1型（MEN1）的致病基因，其在多種胚胎組織和成人組織中表達(dá)。人類(lèi)Men1基因定位于11q13,編碼一個(gè)含610個(gè)氨基酸殘基的蛋白，Menin。多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腺瘤病1型(MEN1)是一種常染色體顯性疾病，以家族性的甲狀旁腺瘤、胰島瘤和垂體前葉腫瘤為特征。而在胚胎發(fā)育中Men1基因純合突變的小鼠也會(huì)引起多種器官缺陷，包括神經(jīng)系統(tǒng)，心臟，肝臟，顱，腦等，并導(dǎo)致胚胎死亡。所以其在胚胎發(fā)育中起重要的作

2、用。但其分子機(jī)制目前仍不甚清楚。 胚胎干細(xì)胞（ESCs）是高度未分化的具有多能性的細(xì)胞，在懸浮培養(yǎng)時(shí)能自動(dòng)相互聚集成一細(xì)胞團(tuán)，這一細(xì)胞團(tuán)稱(chēng)為胚胎體（Ebs）。懸浮培養(yǎng)3-8天，胚胎體（Ebs）形成包含有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的結(jié)構(gòu)，形態(tài)上與6天到8天的卵囊期(egg-cylinder stage)的胚胎相似。培養(yǎng)8-10天時(shí)胚胎體（Ebs）形成一個(gè)大的囊狀結(jié)構(gòu)，類(lèi)似早期胚胎種植到子宮內(nèi)壁后的內(nèi)臟卵黃囊(visceral yol

3、k sac)結(jié)構(gòu)。也就是說(shuō)，以胚胎體（Ebs）方式在體外模擬體內(nèi)的早期胚胎發(fā)育，能夠用來(lái)研究胚胎早期發(fā)育的機(jī)制。 在前期的芯片研究中,我們發(fā)現(xiàn)Sox4基因在野生型（Men1+/+）ES細(xì)胞及Men1基因敲除(Men1-/-)的ES細(xì)胞所形成的EB中存在表達(dá)差異。Sox4(Sry/hydroxymethylglutaryl box transcription factor 4)基因是一個(gè)癌基因，而且在早期胚胎發(fā)育過(guò)程也發(fā)揮重要作

4、用，其基因敲除后的表型與Men1基因敲除所引起的發(fā)育異常有部分的相同。故我們推測(cè)Sox4基因是受Menin調(diào)控的基因之一。我們想通過(guò)報(bào)告基因的方法進(jìn)一步明確Men1基因?qū)ox4基因的調(diào)控作用，為進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。 材料與方法： 1)以野生型(Men1+/+)和Men1基因敲除(Men1-/-)的ES細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察這兩種細(xì)胞在體外分化時(shí)所形成的胚胎體（Ebs）的數(shù)目，形狀，大小等形態(tài)學(xué)上的不同。并提取兩種細(xì)

5、胞所形成的胚胎體（Ebs）的RNA，采用Affymatrix基因表達(dá)譜芯片，分析野生型EB和Men1-/-的EB的基因表達(dá)差異并用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 2)構(gòu)建包含小鼠Sox4基因啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體，利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析Menin對(duì)Sox4基因啟動(dòng)子活性的影響；同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)Sox4基因在Men1-/-的小鼠胚胎成纖維(Mef)細(xì)胞和野生型小鼠胚胎成纖維(Mef)細(xì)胞中的表達(dá)差異

6、。 結(jié)果： 1)觀察兩種ES細(xì)胞所形成的懸浮培養(yǎng)的EB共10天，兩者在數(shù)目、大小上無(wú)明顯差別。MEN1-/-ES細(xì)胞形成的EB中間深色區(qū)域出現(xiàn)缺失和偏向的數(shù)量較正常ES細(xì)胞明顯增多。 而基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)與不同器官發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)變化，如骨發(fā)育：Postn，Runx2，Msx2；肝臟發(fā)育：Kdr；造血系統(tǒng)：Hox9，Kitl；胰腺發(fā)育：Sox4，F(xiàn)oxa1，Btc，Igf2，Nfatc1等。

7、2)Sox4基因啟動(dòng)子活性在Men1-/-的Mef細(xì)胞中明顯高于在野生型的Mef細(xì)胞中的活性，而在Men1-/-的Mef中轉(zhuǎn)入Men1基因后，Sox4基因啟動(dòng)子活性降低。同時(shí)Sox4基因在Men1-/-Mef細(xì)胞的mRNA的表達(dá)是在野生型Mef細(xì)胞中的2.5倍。 結(jié)論： 1）骨發(fā)育：Postn，Runx2，Msx2；肝臟發(fā)育：Kdr；造血系統(tǒng)：Hox9，Kitl；胰腺發(fā)育：Sox4，F(xiàn)oxa1，Btc，Igf2，Nf