1、目的:
　　多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫疾病，最常累及部位為腦室周圍白質(zhì)、視神經(jīng)、脊髓等。其病因及發(fā)病機制迄今不明，目前觀點認(rèn)為，攜帶先天遺傳易感基因的個體，在后天環(huán)境中，因病毒感染、外傷等外因的作用下，誘導(dǎo)中樞髓鞘成分發(fā)生異常自身免疫應(yīng)答而致病。目前傳統(tǒng)的治療方法如糖皮質(zhì)激素、干擾素β等，雖然可以減緩MS的進展，但是，長期服用這些藥物往往會導(dǎo)致

2、嚴(yán)重的副作用。因此，尋找療效好，副作用低的藥物迫在眉睫。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多能、具有抗炎和再生能力的成體干細胞，普遍存在于骨髓和其它組織中，如臍帶(UC)，胎兒肝臟和脂肪組織等。近年來，隨著對間充質(zhì)干細胞的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不僅具有突破譜系屏障分化為神經(jīng)細胞的功能，而且還可以通過抑制免疫反應(yīng)、促進髓鞘再生和誘導(dǎo)神經(jīng)損傷修復(fù)來治療一些神經(jīng)退行性疾病。本實驗通過建立自身免疫性腦脊髓

3、炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠模型，分別采用不同來源的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）對EAE模型小鼠進行治療，觀察各組小鼠在治療過程中病情輕重的變化，并通過一些實驗室檢查來探究其可能的機制，從而為MS的治療提供新的思路和方法。
　　方法:
　　1.采用髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG35-55)作為抗原與完全弗氏佐劑混合

4、免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型。在小鼠發(fā)病后隨機分為對照組，模型組，UCMSC組、ADMSC組和UCMSC-SPK1組，通過尾靜脈給予不同來源的間充質(zhì)干細胞治療，從發(fā)病開始后每隔七天注射一次，共3次;正常對照組和模型組用相同劑量的生理鹽水替代治療。
　　2.采用雙盲法每天對各組小鼠進行神經(jīng)功能缺損評分，持續(xù)33天。
　　3.免疫后第33天處死小鼠，取出腦和脊髓放入-80℃冰箱凍存。
　　4.通過電子顯微鏡觀察各組

5、小鼠脊髓中髓鞘脫失情況。
　　5.通過蛋白印跡法來檢測各組小鼠脊髓中GFAP和MBP的表達。
　　6.研磨脾臟細胞收集脾臟細胞，通過流式細胞儀檢測脾臟中調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+ CD25+和foxp3+）和NK(NK1.1+ CD3-)細胞的比例。
　　7.通過攜帶SPK1基因的腺病毒(Ad-SPK1)轉(zhuǎn)染UCMSC，運用westernblot檢測UCMSC、ADMSC和UCMSC-SPK1中SPK1的表達。
　　

6、結(jié)果:
　　1.MOG35-55和完全弗氏佐劑混合免疫成功制備了EAE小鼠模型。
　　2.Westernblot結(jié)果顯示，相比UCMSC，ADMSC中SPK1的表達量更高，而經(jīng)過攜帶SPK1基因的腺病毒(Ad-SPK1)的轉(zhuǎn)染，UCMSC-SPK1中SPK1的表達量比ADMSC更高。
　　3.雙盲法對各組小鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果顯示，與模型組相比，UCMSC組、ADMSC組和UCMSC-SPK1組小鼠的神經(jīng)功能缺損評分

7、明顯降低;將這三個細胞治療組進行比較發(fā)現(xiàn)，ADMSC組比UCMSC組的神經(jīng)評分降低的更加明顯，而相較ADMSC組，UCMSC-SPK1組小鼠的神經(jīng)缺損評分下降的趨勢更為顯著。
　　4.電鏡下觀察小鼠脊髓髓鞘脫失情況，結(jié)果表明:與正常對照組小鼠相比，模型組中小鼠脊髓的髓鞘大面積脫失;而經(jīng)過細胞治療后髓鞘脫失面積明顯較少，程度顯著減輕;對比三個細胞治療組之間髓鞘脫失情況發(fā)現(xiàn)，相比UCMSC組，ADMSC組和UCMSC-SPK1組小鼠脊

8、髓的改善更加明顯，而這種趨勢在UCMSC-SPK1組中表現(xiàn)的更加顯著。
　　5.Westernblot檢測小鼠脊髓中星形膠質(zhì)細胞活化標(biāo)記蛋白GFAP的表達發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組小鼠脊髓中GFAP的表達明顯增加，而與模型組相比，UCMSC組，ADMSC組和UCMSC-SPK1組小鼠脊髓中GFAP的表達明顯降低;將這三組細胞治療組進行比較發(fā)現(xiàn)，相比UCMSC組，ADMSC組和UCMSC-SPK1組中GFAP的表達降低的更加明顯，而

9、相較ADMSC組，UCMSC-SPK1組小鼠脊髓中GFAP的表達減少的更加顯著。
　　6.Westernblot檢測各組小鼠脊髓中MBP的表達結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠脊髓中MBP的表達明顯減少，而經(jīng)過MSC治療后，各治療組小鼠脊髓中MBP的表達明顯增高;將這三個細胞治療組進行比較發(fā)現(xiàn)，ADMSC組小鼠脊髓中MBP的表達要明顯多于UCMSC組，而這種趨勢在UCMSC-SPK1組中表現(xiàn)的更為顯著。
　　7.流式細胞儀對

10、各組小鼠脾臟中的調(diào)節(jié)性T細胞和NK細胞的比例進行測定，結(jié)果顯示，相較對照組，模型組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細胞的比例明顯降低，而NK細胞的比例卻顯著升高;經(jīng)過細胞治療后，UCMSC組，ADMSC組和UCMSC-SPK1組小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細胞的比例顯著升高，而NK細胞的比例顯著降低;相較UCMSC組，ADMSC組和UCMSC-SPK1組中這種趨勢的表現(xiàn)更為明顯，而與ADMSC組相比，UCMSC-SPK1組中調(diào)節(jié)性T細胞升高和NK細胞降低的表現(xiàn)

11、更為顯著。
　　結(jié)論:
　　1.不同來源的間充質(zhì)干細胞治療都可以顯著減輕EAE模型小鼠神經(jīng)功能缺損評分，其機制可能是通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和促進髓鞘再生來實現(xiàn)的。
　　2.經(jīng)過SPK1基因的轉(zhuǎn)染，UCMSC-SPK1在治療EAE中表現(xiàn)出了比ADMSC更好的療效，而原始的UCMSC卻比ADMSC療效差。
　　3.不同來源的干細胞，其表達的SPK1的量不同，這可能導(dǎo)致了它們在治療EAE模型小鼠療效上的