1、收稿日期：收稿日期：20160428錄用日期：錄用日期：20160815基金項目：基金項目：福州市科技計劃項目（2015S14118）通信作者：通信作者：jiachunfeng_fj@doi:10.6043j.issn.04380479.201604056骨髓間充質(zhì)干細胞對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎小鼠的治療作用研究骨髓間充質(zhì)干細胞對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎小鼠的治療作用研究賈春鋒1，邵林2，戴慶辰1，樂立盛2（1.廈門大學附屬福州第二醫(yī)

2、院福建福州350007；2.福州市經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)醫(yī)院福建福州350007）摘要：摘要：為了探討骨髓間充質(zhì)干細胞對小鼠實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎的治療作用，將36只小鼠隨機分為3組，每組12只。分別為正常對照組、模型組和骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）組。采用不同方法治療，治療8周后，采用蘇木精伊紅（HE）染色觀察小鼠脊髓組織形態(tài)學改變；RTPCR和Westernblot分別檢測小鼠脊髓組織中細胞因子IL1、IL2、IL4、IL6、IL10

3、、IL12、TNFα和IFNγ的mRNA水平和蛋白水平。結果顯示，與對照組比較，模型組IL1、IL2、IL12、TNFα和IFNγ的mRNA水平和蛋白水平上調(diào)（p＜0.05），而IL4和IL10下調(diào)（p＜0.05）；與模型組比較，BMMSCs組IL1、IL2、IL12、TNFα和IFNγ的mRNA水平和蛋白水平下調(diào)（p＜0.05），而IL4和IL10上調(diào)（p＜0.05）。對照組脊髓組織的結構正常，神經(jīng)細胞形態(tài)完好；模型組脊髓組織局部出現(xiàn)

4、明顯空洞，而且瘢痕組織、神經(jīng)細胞非常稀少；BMMSCs組脊髓組織內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)明顯空洞及瘢痕組織，而且有大量神經(jīng)細胞，可見清晰細胞胞體和突起。由上述結果可知，骨髓間充質(zhì)干細胞對實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎小鼠具有治療作用，其機理與抑制炎性蛋白的表達，減少變態(tài)反應性腦脊髓炎對脊髓的損傷有關。關鍵詞：關鍵詞：變態(tài)反應性腦脊髓炎；骨髓間充質(zhì)干細胞；炎性蛋白中圖分類號：中圖分類號：R33文獻標志碼：文獻標志碼：A實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎（experim

5、entalallergicencephalomyelitis，EAE）是常見的多發(fā)性硬化（multiplesclerosis，MS）疾病，MS的發(fā)病特點是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c的自身免疫病[1]。嚴重影響患者的生活，給患者及其家屬帶來很大的經(jīng)濟和心里壓力。但對這方面的研究目前并不多，需要進行詳細的研究。本研究擬建立EAE小鼠模型，采用BMMSCs尾部靜脈注射進行治療，HE染色觀察小鼠脊髓病理形態(tài)變化，RTPCR和We

6、sternblot檢測小鼠脊髓組織中白介素1（IL1）、白介素2（IL2）、白介素4（IL4）、白介素6（IL6）、白介素10（IL10）、白介素12（IL12）、腫瘤壞死因子α（TNFα）和干擾素γ（IFNγ）水平表達的變化。初步探討B(tài)MMSCs治療EAE的作用機制，為臨床治療MS提供新的思路和有力的實驗依據(jù)。min，72℃1min，共40個循環(huán)，最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)

7、物是否為單一特異性擴增條帶，并采用灰度分析軟件進行分析。表1各種炎癥因子引物序列Tab.1Sequencesofinflammatycytokines炎癥因子引物序列上游：5CCAAGACCAGGTACCATG3IL1下游：5GGTTCTGGTCCATGGTAC3上游：5GCCAGGGTTTTCCCAGT3IL2下游：5ACTGGGAAAACCCTGGC3上游：5CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGG3IL4下游：5CCAA

8、CACAATGGCGCGCTTCCCGAG3上游：5ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC3IL6下游：5GCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTAT3上游：5TCAGTGTTAGACTAGTAAATT3IL10下游：5AATTTACTAGTCTAACACTGA3上游：5CCAAGACCAGGTACCATG3IL12下游：5CATGGTACCTGGTCTTGG3上游：5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3

9、TNFα下游：5CTGAGCCAGGATCAAACTCT3上游：5CTCCGAGATCTGGACGAG3IFNγ下游：5CTCGTCCAGATCTCGGAG3上游：5AGTTGCGTTACACCCTTTC3βactin下游：5CCTTCACCGTTCCAGTTT31.3.2Westernblot檢測小鼠脊髓組織中各種炎癥因子的蛋白表達水平檢測小鼠脊髓組織中各種炎癥因子的蛋白表達水平[5]小鼠脊髓組織細胞經(jīng)過處理后，采用各種炎癥因子的蛋白

10、抗體，37℃孵育36h，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，然后用蛋白裂解液使細胞裂解，放置于冰上保持5min后，樣品加入14體積的4蛋白上樣緩沖液，沸水煮沸5min，進行SDSPAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用含按約0.1mLcm2量加入封閉液封閉1h，一抗4℃過夜。次日PBST漂洗3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育2h，ECL顯色。用SDSPAGE進行電泳，并將其轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上。對抗體孵育處理，經(jīng)化學發(fā)光法曝光后觀察