1、[目的]：驗(yàn)證咖啡因?qū)?shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)保護(hù)作用，并探討咖啡因干預(yù)EAE的可能機(jī)制。 [方法]：采用藥理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)方法。(1)實(shí)驗(yàn)分組：雌性Wistar大鼠40只(140～160g)隨機(jī)分成4組：①CFA對(duì)照組(Control組，n=10只)，②經(jīng)典EAE組(EAE組，n=10只)，③咖啡因10mg/kg組(CAF10組，n=10

2、只)，④咖啡因30mg/kg組(CAF30組，n=10只)。抗原致敏前一周，CAF10組和CAF30組開始分別按10mg/kg.d和30mg/kg.d飲用咖啡因，其余各組正常飲水。EAE組、CAF10組、CAF30組Wistar大鼠四肢足墊皮下注射0.4ml的豚鼠脊髓勻漿(guineapigspinalcordhomogenate，GPSCH)和完全弗氏佐劑(completeFreud’sadjuvant，CFA)制成的抗原乳劑，免疫誘

3、導(dǎo)EAE模型。Control組四肢足墊皮下注射0.4ml的生理鹽水和CFA制成的混合乳劑。GPSCH-CFA免疫當(dāng)日定為第0天。所有大鼠分別于0、48h腹股溝皮下注射百日咳疫苗0.1ml(1×109菌體)。(2)觀察指標(biāo)：每日觀察并記錄動(dòng)物體重及行為學(xué)的變化兩次。觀察咖啡因?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物的EAE發(fā)病率、神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響。致敏后第20天處死動(dòng)物，取胸髓、腰髓、大腦和腦干以4％多聚甲醛固定，送做病理學(xué)檢查，應(yīng)用蘇木素-伊紅和Kluver&

4、Barrera髓鞘染色方法觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centrolnervoussystem，CNS)病理變化；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)法檢測(cè)頸髓干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-

5、B1)和腺苷A1、A2A受體mRNA的表達(dá)。 [結(jié)果]： (1)行為學(xué)觀察：EAE大鼠于免疫后11天開始陸續(xù)發(fā)病，12-15天為發(fā)病高峰期。EAE組平均潛伏期為12.00±0.53天，與EAE組相比，CAF10mg/kg組(14.67±0.88天)和CAF30mg/kg組(14.50±1.04天)潛伏期明顯延長(zhǎng)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。患病大鼠發(fā)病前2-3天出現(xiàn)進(jìn)食減少、體重下降、活動(dòng)減少，繼而出現(xiàn)尾巴無(wú)力、遠(yuǎn)端

6、下垂、癱瘓，隨后出現(xiàn)步態(tài)蹣跚、跛行、后肢無(wú)力、癱瘓等癥狀，多伴有大小便失禁，嚴(yán)重者累及前肢，部分出現(xiàn)肢體癱瘓而不伴尾巴癱瘓。EAE組發(fā)病率8/10，CAFlomg/kg組和CAF30mg/kg組發(fā)病率為4/10，與EAE組相比有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。EAE組最大癥狀評(píng)分達(dá)3.63±0.18，CAF10mg/kg組(2.67±0.33)明顯低于EAE組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Control組大鼠體重持續(xù)增加，也未見尾巴無(wú)力、下

7、垂、麻痹和后肢無(wú)力、麻痹等異常。 (2)病理學(xué)改變：EAE組的腦、脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(以淋巴細(xì)胞為主)，神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性、壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生，典型者可見血管套形成、噬神經(jīng)現(xiàn)象。其中以腦干、脊髓處病理改變最為明顯。Kluver&Barrera髓鞘染色可見廣泛的神經(jīng)髓鞘變性、脫失。CAF10mg/kg和CAF30mg/kg組炎細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘變性、脫失程度比EAE組減輕。 (3)RT-PCR檢測(cè)：①CD4+T型細(xì)胞

8、因子：EAE組大鼠頸髓內(nèi)的IFN-γ、IL-10、TGF-β1的mRNA表達(dá)比Control組大鼠升高；CAF10組和CAF30組表達(dá)的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ比EAE組明顯下降(P＜0.05)，Treg型細(xì)胞因子TGF-β1的mRNA表達(dá)比EAE組升高(P＜0.05)。②A1、A2A腺苷受體：A1受體的mRNA水平在EAE組大鼠頸髓內(nèi)比Control組大鼠下調(diào)，該受體在CAF10組和CAF30組內(nèi)比EAE組明顯上調(diào)，且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義(P＜0.01)；EAE組大鼠頸髓內(nèi)的A2A受體比Control組大鼠稍有上調(diào)，同EAE組相比，該受體在CAF10組和CAF30組內(nèi)略有上升，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)論]： (1)低劑量的咖啡因(10mg/kg和30mg/kg)慢性處理能減輕EAE病情。 (2)EAE發(fā)病與腺苷受體有聯(lián)系：EAE大鼠頸髓內(nèi)A1腺苷受體(adenosineA1receptor,A1AR)的表達(dá)比正常大鼠明顯下調(diào)。 (3)A1