1、SHP—1和SHP—2都屬于非受體樣的蛋白酪氨酸磷酸酶，在細胞磷酸化調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著非常重要的作用。盡管SHP—1和SHP—2在基因序列上有55％的同源性，SHP—1/SHP—2在機體內(nèi)卻各自具有不同的生物學(xué)功能：SHP—1主要在造血細胞和上皮細胞中表達，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中主要起負調(diào)控作用；而SHP—2則在各種類型的細胞中都有表達，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中主要起正調(diào)控作用。研究表明SHP—1/SHP—2通過對其底物的特異選擇及作用，來實現(xiàn)其對細胞

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的選擇，進而對細胞間通信、細胞生長和增殖、細胞周期調(diào)控、分化、細胞遷移產(chǎn)生影響。那么，SHP—1/SHP—2是如何在眾多的底物中選擇各自的特異性底物，并發(fā)揮其相應(yīng)的生物學(xué)功能的機制至今未見有詳實的報道。此問題引起了相關(guān)領(lǐng)域研究人員的極大關(guān)注。
　　 課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，除SHP—1/SHP—2催化活性域的中心裂隙外，催化活性域的β5—loop—β6區(qū)域內(nèi)存在3個有區(qū)別的氨基酸殘基，對SHP—1/SHP—2催化活性域

3、的底物特異性選擇有重要影響?；诖吮菊n題擬通過HPLC純化獲得SHP—1/SHP—2的催化活性域蛋白(D1C/D2C)及其突變體蛋白(D1C3M、D1C4M、D2C3M和D2C4M)，然后分別以合成的磷酸化酪氨酸(PY)、表達純化的單磷酸化位點PZR YS/Y6和SPAP2a Y1—Y4蛋白為反應(yīng)底物，來分析D1C/D2C及其突變體的底物特異性，從而確證出D1C/D2C的單磷酸化特異性底物；并進一步揭示SHP—1/SHP—2催化活性域β

4、5—loop—β6區(qū)域內(nèi)3個有區(qū)別的氨基酸殘基對D1C/D2C底物特異性的影響。
　　 首先，為了獲得大量純化D1C/D2C及其各突變體的蛋白。試驗中D1C/D2C及其各突變體的菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、菌體裂解緩沖液懸浮和超聲波破碎后，通過HPLC分離純化D1C/D2C及其各突變體的蛋白，所得產(chǎn)物進行SDS—PAGE電泳檢測。結(jié)果表明：(1)成功地表達了D1C/D2C及其各突變體蛋白，分子量大小分別為34.6KD和35.3KD

5、，且各蛋白均以可溶性的方式進行表達。(2)通過HPLC技術(shù)可有效地分離純化出大量的D1C/D2C及其各突變體蛋白。
　　 其次，對D1C/D2C及其各突變體蛋白的酶動力學(xué)特性進行初步探討，為后續(xù)的底物特異性研究奠定了理論基礎(chǔ)。試驗中以PY作為去磷酸化反應(yīng)的底物，利用孔雀綠顯色法，通過雙倒數(shù)作圖法對純化的D1C/D2C及其各突變體蛋白進行酶動力學(xué)特性分析。結(jié)果表明：(1)純化的D1C/D2C及其各突變體蛋白均具有磷酸酶活性。(2)

6、純化的D1C、D1C3M和D1C4M，D2C和D2C3M的酶動力學(xué)反應(yīng)常數(shù)基本一致，D2C4M發(fā)生較大變化。(3)D1C及其突變體的磷酸酶活性要高于D2C/D2C3M約1.5—2倍。
　　 然后，為了獲得單磷酸化的PZR Y5/Y6蛋白，用于D1C/D2C及其各突變體的底物特異性分析。本試驗以His—PZR原核表達載體為模板，利用特異的點突變引物，經(jīng)PCR重疊延伸法擴增獲得單磷酸化位點的PZR Y5/Y6片斷，并分別構(gòu)建其相應(yīng)的

7、原核表達載體。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與C—Src原核表達載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，并通過IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達，表達產(chǎn)物進行SDS—PAGE和Western—Blot檢測。檢測的表達菌體利用裂解液懸浮和超聲波破碎后，經(jīng)Ni—NTA瓊脂糖凝膠純化單磷酸化的PZR Y5/Y6蛋白。所得純化產(chǎn)物通過Western—Blot和孔雀綠顯色法用于D1C/D2C及其各突變體的底物特異性分析。結(jié)果表明：(1)已成功地表達了單磷酸化的PZR Y5/Y6

8、蛋白，分子量大小為9.14KD，且蛋白均以可溶性的方式進行表達。(2)磷酸化的PZRY5/Y6是D1C的特異性底物。(3)D2C3M在一定程度上實現(xiàn)了底物特異性的轉(zhuǎn)變，催化活性較D2C強，介于D1C和D2C之間。
　　 最后，為了獲得單磷酸化的SPAP2aY1—Y4蛋白，用于D1C/D2C及其各突變體的底物特異性分析。本試驗分別以GST—SPAP2a Y1—Y4原核表達載體DNA為模板，利用含6×His—Tag融合標簽的突變引物

9、，經(jīng)PCR擴增獲得含6×His—Tag融合標簽的單磷酸化位點的SPAP2a Y1—Y4片斷，并分別構(gòu)建其相應(yīng)的原核表達載體。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與C—Src原核表達載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，并通過IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達，表達產(chǎn)物進行SDS—PAGE和Western—Blot檢測。檢測的表達菌體利用裂解液懸浮和超聲波破碎后，經(jīng)Ni—NTA瓊脂糖凝膠純化單磷酸化的SPAP2aY1—Y4蛋白。所得純化產(chǎn)物通過Western—Blot檢測用

10、于D1C/D2C及其各突變體的底物特異性分析。結(jié)果表明：(1)已成功地表達了含6×His—Tag融合標簽單磷酸化的SPAP2aY1—Y4蛋白，分子量大小為16.8KD，且蛋白均以可溶性的方式進行表達。(2)磷酸化的SPAP2a Y1、Y2和Y4是D1C的特異性底物，磷酸化的SPAP2a Y3是D2C的特異性底物。(3)以SPAP2a.Y2為底物，D2C3M在一定的程度上實現(xiàn)了底物特異性的轉(zhuǎn)變，催化活性較D2C強，介于D1C和D2C之間。

11、(4)以SPAP2a Y3為底物，D1C4M在一定的程度上實現(xiàn)了底物特異性的轉(zhuǎn)變，催化活性較D1C強，介于D1C和D2C之間。
　　 綜上所述，本課題已順利完成了對D1C/D2C單磷酸化特異性底物的確證，及對β5—loop—β6區(qū)域內(nèi)3個有差異的氨基酸殘基對于底物特異性影響的揭示。該研究成果為將來研究SHP—1/SHP—2催化活性域的底物特異性和催化機制，及日后選擇特異性底物用于生成酶—底物復(fù)合晶體提供了理論依據(jù)；同時，也為進一