1、研究目的:
　　結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)報(bào)道，全球結(jié)直腸癌每年新發(fā)病例數(shù)約120萬(wàn)，發(fā)病率居所有惡性腫瘤中的第3位，病死率居第4位。此外，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡呈年輕化特點(diǎn)。轉(zhuǎn)移是引起CRC患者死亡的首要原因，大多數(shù)病人在確診時(shí)就已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，深入探討結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找早期診斷、早

2、期治療和預(yù)防的有效途徑，始終是結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。
　　TLE4基因是Groucho/Tle基因家族的重要成員之一，Groucho/Tle蛋白在胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)通路的活性，包括受體酪氨酸激酶/Ras/MAPK、Notch、Wnt、Hedgehog、JNK等信號(hào)通路。據(jù)報(bào)道，TLE4在造血功能、骨發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，有研究提示TLE4在急性髓性白血病(acute myelogeno

3、us leukemia，AML)中起著抑制作用。在白血病細(xì)胞株中下調(diào)TLE4表達(dá)可以增加白血病細(xì)胞的分裂，過(guò)表達(dá)TLE4可引起細(xì)胞凋亡的增加。然而，關(guān)于TLE4在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的實(shí)體腫瘤中的作用知之甚少。我們前期的生物信息學(xué)分析顯示，TLE4在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于配對(duì)的癌旁正常腸粘膜組織;但是，TLE4在結(jié)直腸癌發(fā)生和演進(jìn)過(guò)程中的作用及分子機(jī)制目前尚不清楚。
　　本課題擬檢測(cè)TLE4蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析其表

4、達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系，并通過(guò)多種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究TLE4在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及相關(guān)分子機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌的個(gè)體化診療和靶向藥物的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.運(yùn)用公共數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)數(shù)據(jù)分析TLE4在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況;
　　2.利用Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)TLE4在新鮮結(jié)直腸癌和配對(duì)癌旁正常組織標(biāo)本中的表達(dá)情況;通過(guò)免疫組化技術(shù)檢

5、測(cè)結(jié)直腸癌患者石蠟組織標(biāo)本中TLE4的表達(dá)，分析其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后間的相關(guān)性;
　　3.通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建TLE4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TLE4和相關(guān)信號(hào)通路蛋白在穩(wěn)定細(xì)胞株中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況;
　　4.通過(guò)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)體外檢測(cè)TLE4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，通過(guò)Tra

6、nswell實(shí)驗(yàn)體外檢測(cè)TLE4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響;利用裸鼠皮下成瘤模型，并運(yùn)用免疫組化實(shí)驗(yàn)體內(nèi)檢測(cè)TLE4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力的影響;
　　5.實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)TLE4穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾后結(jié)直腸癌細(xì)胞中JNK/c-Jun通路及其相應(yīng)靶點(diǎn)分子的變化;
　　6.使用JNK抑制劑SP600125處理SW480/TLE4和HT29/TLE4細(xì)胞24小時(shí)后，進(jìn)

7、一步通過(guò)Western blot檢測(cè)JNK/c-Jun通路及其相應(yīng)靶點(diǎn)分子的變化，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。
　　研究結(jié)果:（數(shù)據(jù)使用SPSS20.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析）
　　1.TLE4在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平較配對(duì)癌旁正常組織顯著升高;其表達(dá)水平與患者Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間呈正相關(guān)關(guān)系;

8、　　2.Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，TLE4高表達(dá)組的總體生存率顯著低于低表達(dá)組，與患者的生存預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;
　　3.TLE4的過(guò)表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和裸鼠皮下成瘤能力，而干擾TLE4表達(dá)后則抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和裸鼠皮下成瘤能力;
　　4.TLE4能激活JNK/c-Jun分子信號(hào)通路的活性，使用JNK/c-Jun分子信號(hào)通路阻滯劑SP600125能夠抵消TLE4促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移