1、急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）表現(xiàn)為突然腎功能下降導(dǎo)致含氮廢物（尿素氮和肌酐）的累積，是一種常見的臨床問題，伴隨著發(fā)病率增加、嚴(yán)重的后果、令人不滿意的治療選擇和一個巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是一種潛在的威脅生命的疾病。有研究報道，普通住院患者中AKI的發(fā)病率約為5％，且每年全球范圍內(nèi)有200萬人死于此疾病。多項流行病學(xué)統(tǒng)計顯示我國AKI的患病率亦呈現(xiàn)逐年上升趨勢，其中約19％的患者最終需要接受腎臟替代治療，是我國

2、住院患者及社區(qū)人群中一類常見的、多重病因的、危重的臨床綜合征。雖然血液凈化技術(shù)已得到長足發(fā)展，但AKI的病死率仍高達(dá)40％～50％。AKI在實驗動物模型和臨床研究上一直得到廣泛的研究，這些大幅度的增加了我們對AKI發(fā)生發(fā)展和恢復(fù)進(jìn)程的理解。然而目前沒有特別的方法來阻止或治療AKI。因此，進(jìn)一步理解AKI的病理生理機(jī)制對于發(fā)現(xiàn)潛在的治療策略和治療靶點(diǎn)來治療AKI是非常重要的。
　　腎缺血/再灌注損傷（ischemia reperfu

3、sion injury，IRI）是AKI的一種常見原因。IRI機(jī)制復(fù)雜，目前文獻(xiàn)報道的一些影響因素包括ATP缺失導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙和腎小管細(xì)胞損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca2+堆積、超氧根離子(O2-)和一氧化氮(nitric oxide，NO)的失衡、ROS的過多釋放、促炎癥細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡信號通路等在腎缺血再灌注損傷中起著重要的作用。然而，AKI的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，還沒有被很好的闡釋。在AKI發(fā)展過程中考慮血流動力學(xué)的改變和變化的作用也顯得

4、尤為重要。在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型中，增加小管內(nèi)壓力和小管牽拉力會上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β-1（transforming growth factorβ-1， TGFβ-1)，進(jìn)而誘導(dǎo)小管間質(zhì)性炎癥和纖維化。周期性拉伸腎小管上皮細(xì)胞會誘導(dǎo)經(jīng)由激活JNK/SAPK和p38 SAPK-2信號通路的細(xì)胞凋亡。另外，C57BL/6小鼠中，與夾閉腎動脈阻塞損傷相比，夾閉腎靜脈阻塞會產(chǎn)生

5、更嚴(yán)重的小管損傷和更高水平的血漿肌酐。慢性心衰病人中，腎小球濾過率(glomerular filtration rate，GFR)檢測結(jié)果顯示靜脈阻塞是腎功能損傷的主要決定因素。這些研究還表明，較高的小管壓力可能導(dǎo)致腎損傷。然而，小管內(nèi)壓力在IRI誘導(dǎo)的AKI發(fā)展中的作用還不清楚。
　　目前的研究現(xiàn)狀看，缺血階段和再灌注階段分開研究腎小管壓力在腎損傷中的作用及腎臟血流動力學(xué)角度的研究目前還很少，腎血流動力學(xué)在IRI最初階段發(fā)展的意

6、義還不清楚。本研究從腎缺血階段和再灌注階段分別控制腎小管內(nèi)壓力后，觀察是否能夠改善腎缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷？以及研究腎臟損傷后血流動力學(xué)及腎臟自調(diào)控的改變機(jī)制。
　　第一部分:腎小管內(nèi)壓力在急性腎損傷缺血階段中的作用機(jī)制
　　目的:
　　本部分內(nèi)容通過構(gòu)建C57BL/6小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷模型，研究探討該模型下小鼠腎小管壓力在缺血階段的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.戊巴比妥鈉麻醉小鼠（50

7、mg/kg，intraperitoneal injection，I.P.），整個實驗過程維持小鼠體溫37℃，通過無創(chuàng)動脈夾阻斷腎血流量18 min，分為以下三組:
　　1）雙側(cè)腎動脈夾閉組（renal arteries，RA組）;
　　2）雙側(cè)腎蒂（包括動脈和靜脈）夾閉組（renal pedicles，RP組）;
　　3）雙側(cè)腎靜脈夾閉組（renal veins，RV組）。相同的手術(shù)操作過程和時間，但不阻斷腎血流量的組

8、別作為正常對照組（Sham組）。
　　2.戊巴比妥鈉麻醉小鼠，整個實驗過程維持小鼠體溫37℃，通過無創(chuàng)動脈夾阻斷腎靜脈18 min，夾閉腎靜脈之前，通過調(diào)節(jié)腎動脈的壓力，分為三組:
　　1）正常腎動脈壓力組（normal renal artery pressure，NP組）;
　　2）低腎動脈壓力組(lowrenal artery pressure，LP組);
　　3）高腎動脈壓力組（high renal art

9、ery pressure，HP組）。
　　3.采用國際領(lǐng)先的、難度較高的腎臟微穿刺技術(shù)(mieropuncture)測量小鼠腎臟近端小管的壓力，比較不同組別小鼠小管內(nèi)壓力的差異。
　　4.收集小鼠血漿，一部分送去實驗中心用生化儀檢測肌酐(creatinine)，腎損傷因子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase asso

10、ciated lipocalin，NGAL)按照公司的ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
　　5.采用發(fā)射器的植入和平均動脈壓(mean artery pressure，MAP)測量系統(tǒng)進(jìn)行測量MAP值。
　　6.高碘酸希夫(Periodic Acid Schiff，PAS)染色:將組織取出并用4％多聚甲醛固定，切片，石蠟包埋，然后按PAS的染色流程染色并于顯微鏡下觀察拍照。
　　結(jié)果:
　　1.腎缺血條件下，RP

11、組和RV組腎小管壓力增加，RA組腎小管壓力減少，而正常組一直維持不變。缺血階段，各組之間的MAP沒有明顯變化。
　　2.與Sham組比較，缺血再灌注24 h后三個實驗組的creatinine、KIM-1和NGAL顯著增加，并且RV組升高最多，然后分別是RP組和RA組。
　　3.缺血再灌注24 h后腎臟切片PAS染色顯示，RV組有最嚴(yán)重的小管損傷和小管壞死，然后分別是RP組和RA組。
　　4.缺血階段通過改變腎動脈壓力而

12、調(diào)控腎小管內(nèi)的壓力，觀察到腎動脈壓力與腎小管壓力呈正相關(guān)。
　　5.缺血階段通過改變腎動脈壓力而調(diào)控腎小管內(nèi)的壓力后，creatinine、KIM-1和NGAL隨著小管內(nèi)壓力的增加而增加，腎臟損傷也隨之加重。
　　6.通過調(diào)控缺血階段腎小管壓力后的缺血再灌注腎臟PAS染色顯示，HP組腎小管阻塞引起的腎小管損傷和腎小管壞死最嚴(yán)重，然而三組中LP組表現(xiàn)最輕。
　　結(jié)論:
　　本研究表明，腎臟缺血階段，夾閉腎動脈、腎靜

13、脈或腎蒂組織所導(dǎo)致的AKI損傷程度與腎小管內(nèi)壓力呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，缺血前通過增加腎動脈壓力升高腎小管的壓力后會促進(jìn)AKI疾病的發(fā)生發(fā)展，而降低腎小管內(nèi)壓力可以對腎臟功能起到保護(hù)作用。這些研究結(jié)果不僅提供了AKI機(jī)制的新視野，也表明調(diào)控小管壓力可能是一個潛在的治療AKI的新策略。
　　第二部分:腎小管壓力在急性腎損傷再灌注階段中的作用機(jī)制
　　目的:
　　本部分研究內(nèi)容通過構(gòu)建C57BL/6小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)

14、的急性腎損傷模型，探討該模型下小鼠腎小管內(nèi)壓力在再灌注階段的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.用戊巴比妥鈉注射液麻醉小鼠(50 mg/kg，I.P.)，整個實驗過程維持小鼠體溫37℃，通過無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎動脈18 min，分為以下三組:
　　1）正常再灌注壓力組;
　　2）低再灌注壓力組;
　　3）高再灌注壓力組。相同的手術(shù)操作過程和時間，但不阻斷腎血流量的組別作為Sham組。
　　2.采用國際領(lǐng)先

15、的、難度較高的腎臟微穿刺技術(shù)測量小鼠腎臟近端小管的壓力，比較不同組別小鼠腎小管壓力的差異。
　　3.收集小鼠血漿，creatinine送去實驗中心用生化儀檢測，KIM-1和NGAL按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。
　　4.PAS染色:將組織取出并用4％多聚甲醛固定，切片，石蠟包埋，然后按PAS的染色流程染色并于顯微鏡下觀察拍照。
　　5.收集坦帕綜合醫(yī)院腎移植病人的數(shù)據(jù)，分析起始灌注壓力和移植腎功能的相關(guān)性。

16、>　　結(jié)果:
　　1.通過調(diào)控起始灌注階段腎動脈壓力可以影響腎小管內(nèi)壓力。
　　2.缺血再灌注損傷標(biāo)志物creatinine、KIM-1和NGAL顯示，與正常再灌注壓力組比較，減少再灌注階段腎動脈壓力，進(jìn)而減少小管內(nèi)壓力可以減輕急性腎損傷;反之，增加再灌注階段腎動脈壓力，進(jìn)而增加小管內(nèi)壓力會加重急性腎損傷。
　　3.PAS結(jié)果和腎損傷標(biāo)志物的趨勢吻合，和正常再灌注壓力組比較，減少再灌注階段腎小管壓力可以減輕腎組織切片腎

17、小管的阻塞和壞死;反之，增加再灌注階段腎小管壓力會加重腎組織切片腎小管的阻塞和壞死。
　　4.分析腎移植病人數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，血壓和creatinine有一個正相關(guān)性，這些結(jié)果支持了我們的假說:降低再灌注階段的壓力可以保護(hù)腎功能和減輕腎損傷。
　　結(jié)論:
　　本部分研究表明，控制缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷過程中再灌注壓力可以明顯改善腎功能和減輕急性腎損傷。
　　第三部分:缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷的血流動力學(xué)研究

18、r>　　目的:
　　本部分研究通過構(gòu)建C57BL/6小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷模型，探討該模型下小鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的改變。
　　方法:
　　1.戊巴比妥鈉麻醉小鼠，然后做如下手術(shù)(整個手術(shù)過程維持小鼠體溫37℃):
　　1)通過右側(cè)頸動脈插管測量小鼠MAP;
　　2）通過無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)腎動脈18 min作為IR組，相同的手術(shù)操作過程和時間，但不阻斷雙側(cè)腎動脈的組別作為Sham組。
　　2.釋放

19、動脈夾后:
　　1）立即通過腎血流量測定儀檢測腎血流量改變;
　　2）每隔15 min應(yīng)用難度較高的腎臟微穿刺技術(shù)檢測近端小管管內(nèi)壓力改變，測量60 min以上。
　　3.Sham組和IR組小鼠手術(shù)后用腎血流量(renal blood flow，RBF)測定儀檢測1 min作為基礎(chǔ)值，然后通過夾閉腸系膜動脈1min而升高動脈壓，觀察RBF的改變而評估腎臟自調(diào)控功能。
　　4.采用腎臟微穿刺技術(shù)測量小鼠體內(nèi)管球反饋

20、(tubuloglomerular feedback，TGF)反應(yīng)，選擇兩個時間點(diǎn):
　　1）缺血再灌注手術(shù)后立即測量;
　　2）缺血再灌注手術(shù)七天后測量，比較Sham組和IR組小鼠TGF的差異。
　　5.體外運(yùn)用缺氧/復(fù)氧模型模擬體內(nèi)缺血再灌注情況，然后采用體外腎小球旁器(juxtaglomerular apparatus，JGA)灌注技術(shù)檢測小鼠正常組和缺氧/復(fù)氧組的TGF差異性。
　　6.采用國際領(lǐng)先的、國

21、內(nèi)首創(chuàng)的、難度較高的單個腎小球入球動脈顯微微灌注技術(shù)檢測正常組和缺氧/復(fù)氧組的肌源性反應(yīng)差異性。
　　結(jié)果:
　　1.腎缺血再灌注后，腎小管壓力增加，雖然隨著時間延長腎小管壓力有所減少，但相對于Sham組還是很高。
　　2.與Sham組比較，缺血再灌注24 h后，通過升高動脈壓觀察到腎血流量增加，表明腎臟腎血流量自調(diào)控功能被損害。
　　3.與Sham組比較，缺血再灌注24 h后腎臟TGF功能暫時性減弱，手術(shù)七天后