1、MicroRNAs(miRNAs)是一類小的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，主要通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)配對來降解靶基因mRNA或抑制其表達(dá)，實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控。近年來，microRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用使其逐漸成為腫瘤檢測標(biāo)記和癌癥治療潛在靶標(biāo)而受到廣泛研究。MiR-424-5p被報道在多種腫瘤中異常調(diào)節(jié)，但是其在人類非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的作用和分子機制研究還有待明確。本文主要研究了miR-424-5p在N

2、SCLC細(xì)胞A549中的作用及其相關(guān)分子機制。
　　1、miR-424-5p在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及對肺癌細(xì)胞A549的影響
　　本研究首先利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測miR-424-5p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460中的表達(dá)。結(jié)果表明，與正常支氣管上皮細(xì)胞HBE相比，miR-424-5p在A549中的表達(dá)明顯升高，而在H460細(xì)胞中的表達(dá)無顯著差異，因此本實驗選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。其次，設(shè)計

3、合成miR-424-5p的抑制物(miR-424-5p inhibitor)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中，通過轉(zhuǎn)染熒光對照確定最適轉(zhuǎn)染濃度，根據(jù)轉(zhuǎn)染24h后的熒光強度選擇100 nM為miR-424-5p inhibitor的最佳轉(zhuǎn)染濃度。最后，利用RT-qPCR的方法檢測轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor后對miR-424-5p表達(dá)的抑制效率，結(jié)果顯示miR-424-5p的表達(dá)水平降低了34.74％。

4、　　本研究同時檢測了miR-424-5p對腫瘤細(xì)胞惡性表型的影響。CCK-8實驗結(jié)果表明抑制miR-424-5p后，A549細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，平板克隆實驗表明抑制miR-424-5p后，A549細(xì)胞克隆形成數(shù)與對照組相比下降了52.11％，流式分析結(jié)果表明抑制miR-424-5p后，A549細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，約為對照組的5倍。利用劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移，結(jié)果表明抑制miR-424-5p后，與對照組相

5、比，細(xì)胞劃痕愈合能力減弱，A549細(xì)胞遷移率下降了39.43％，Transwell實驗同時表明A549細(xì)胞的侵襲受到明顯抑制，約為對照組的37.60％。
　　2、miR-424-5p與靶基因CLOCK之間的相互作用
　　為了研究miR-424-5p的作用途徑，通過Targetscan等軟件在線預(yù)測了miR-424-5p的靶基因，候選基因為ASH1L、CLOCK、RICTOR、WEE1、PPPP1R11、PDCD4、SOCS6

6、和SUZ12。利用RT-qPCR方法檢測了這些基因在HBE、A549及轉(zhuǎn)染miR-424-5p后A549細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果表明，AH1L、 CLOCK、PPPP1R11和PDCD4在A549細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于對照組（HBE），而在抑制miR-424-5p后的A549細(xì)胞中這些基因的表達(dá)明顯升高。隨后，利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CASH1L、CLOCK、PPPP1R11和PDCD4是否為miR-424-5p的靶基因，結(jié)果表明CLOCK

7、基因為miR-424-5p的一個靶基因。Western Blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-424-5p inhibitor后CLOCK蛋白表達(dá)明顯升高，這與mRNA的表達(dá)變化相一致，進(jìn)一步證明CLOCK基因為miR-424-5p的靶基因。為了進(jìn)一步分析miR-424-5p和CLOCK基因的相互作用關(guān)系，本研究利用基因編輯技術(shù)在A549細(xì)胞中過表達(dá)CLOCK基因。結(jié)果顯示，過表達(dá)CLOCK后miR-424-5p的表達(dá)與對照組無顯著差異，但是顯著

8、抑制了A549細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成能力。
　　綜上所述，miR-424-5p在肺癌細(xì)胞A549中高表達(dá)，抑制miR-424-5p的表達(dá)后，可降低A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。確定CLOCK是miR-424-5p的一個靶基因，抑制miR-424-5p表達(dá)后CLOCK的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯升高，而CLOCK基因的過表達(dá)雖然不影響miR-424-5p的表達(dá)，但顯著抑制了細(xì)胞惡性表型。因此，miR-424