1、免疫熒光測定法(immunofluorescence assay，IFA)在醫(yī)學和生物學研究中的應用已有近60年的歷史，其原理就是將抗原抗體反應的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合，以熒光物質(zhì)標記抗體，對組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)進行定位檢測。然而，傳統(tǒng)熒光染料在熒光顯微鏡激發(fā)光照射下易發(fā)生光漂白現(xiàn)象，而且傳統(tǒng)抗體制備及標記方法易降低抗體效價并產(chǎn)生非特異性染色。因此開發(fā)新的熒光標記物及標記方法是很有意義的。近年來，關于綠色熒光蛋白(gr

2、eenfluorescent protein，GFP)融合單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)檢測相應抗原的報道很多，但每檢測一種抗原就要制備相應的融合抗體且敏感性較差。葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SPA)具有和人等多種動物IgG結(jié)合的能力，被稱為“廣泛二抗”，可為多種標記物所標記，已廣泛用于各種免疫測定技術的間接法。用SPA代替scFv與GFP融合表達

3、將有望得到一種新型免疫熒光檢測試劑以彌補以上不足。 基于以上設想，本實驗室構(gòu)建了spa與egfp融合基因的原核分泌表達載體pEZZl8/egfp，并在大腸桿菌(Ecoli DH5α)中成功表達，得到的融合蛋白既有熒光活性又有IgG結(jié)合活性，但原核分泌表達存在分泌效率低、胞內(nèi)表達產(chǎn)物分離純化步驟繁瑣且信號肽不能有效切除等問題。本研究在前期工作基礎上將spa-egfp融合基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichiapastor GSll5)進

4、行分泌表達，克服了上述缺點，并初步研究了表達產(chǎn)物SPA-EGFP作為一種新型免疫熒光檢測試劑在免疫診斷方面的應用表現(xiàn)。 本研究通過PCR技術從質(zhì)粒pEZZl8/egfp)中擴增出spa-egfp融合基因，再將其克隆至畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPIC9K/spa-egfp，并測序鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)SalI線性化后，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5，經(jīng)組氨酸營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(MD平板)和YPD-G418平板篩

5、選得到高拷貝酵母轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定，甲醇誘導表達。培養(yǎng)上清經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，誘導表達蛋白的表觀分子量約為43kD，與預期的融合蛋白分子量相近，初步驗證了融合蛋白的分泌表達。通過比較不同G418抗性工程菌的表達量，確定最佳表達菌株為1.5mg/L G418抗性的工程菌，誘導84h時表達量最高。通過正交設計對影響畢赤酵母表達量的幾個因素水平進行優(yōu)化，確定添加磷酸鉀緩沖液使培養(yǎng)基pH值保持7.0，同時添加1％的Casamino ac

6、ids，目的蛋白的表達量提高了341.4％，達到107mg/L，占培養(yǎng)上清總蛋白的70％以上。培養(yǎng)上清經(jīng)鎳柱親和層析一步純化后得到的蛋白在SDS-PAGE上顯示為約43kD的單一條帶，純度達95％以上。該蛋白的熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜經(jīng)測定與EGFP基本一致；競爭ELISA實驗還顯示該蛋白具有IgG結(jié)合活性，以上均說明融合蛋白SPA-EGFP在畢赤酵母中的分泌表達獲得成功，與原核表達比較，表達量得到大幅度提高，信號肽能有效切除，分離純

7、化步驟簡單易行。 免疫熒光測定法在臨床上已用作病原體的檢驗及自身免疫性疾病的診斷等。本研究以純化的融合蛋白SPA-EGFP替代FITC標記的羊抗人IgG抗體，用于抗細胞核抗體(ANA)的間接免疫熒光檢測、天皰瘡抗體的直接免疫熒光檢測、抗肺炎支原體IgG抗體的間接免疫熒光檢測均獲得良好的結(jié)果，初步驗證了其作為一種新型免疫熒光檢測試劑在免疫熒光測定中應用的可行性及優(yōu)勢。 本研究取得的主要成果有： (1)成功構(gòu)建