1、目的：
　　觀察Hedgehog/Gli通路在Sr促使BMSCs分化為成骨細(xì)胞過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　1.大鼠BMSCs的分離、純化及培養(yǎng)
　　取1只4周齡的SD大鼠，采用頸椎脫臼法處死大鼠后，將其浸泡在75％的乙醇中消毒5 min，取出放置在預(yù)先經(jīng)紫外線消毒過(guò)的超凈臺(tái)上，在無(wú)菌條件下剪開(kāi)大鼠的皮膚、肌肉，分離出兩側(cè)的股骨和脛骨，將骨周圍的肌肉和筋膜等組織盡量剔除干凈，小心剪去股骨近端及脛骨遠(yuǎn)端使骨髓腔暴

2、露，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集含細(xì)胞的培養(yǎng)基至15 ml的無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心5 min，離心后棄去上清液，在離心管中再加入5ml的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液接種至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后待細(xì)胞貼壁行首次換液，以后每隔2～3d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài)，直至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80％～90％融合時(shí)進(jìn)行1∶2

3、或1∶3傳代純化。
　　2.BMSCs的成骨分化
　　待BMSCs傳代至第3-5代時(shí)，將細(xì)胞種植于培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80％～90％以上融合后，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)組的要求加入不同的干預(yù)措施以及含10％胎牛血清、1×10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和50 mg/L抗壞血酸的DMEM/F12培養(yǎng)液配制而成的成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)。
　　3.Western blot法檢測(cè)Gli1和Runx2蛋

4、白的表達(dá)
　　待BMSCs傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)，將細(xì)胞接種在60 mm的培養(yǎng)皿中，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的干預(yù)措施后，開(kāi)始操作。棄去細(xì)胞原培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗2遍，將皿中剩余的PBS吸干，然后在皿中加入適量細(xì)胞裂解液，放置在4℃冰箱進(jìn)行裂解30 min，裂解完成后收集細(xì)胞，于12000 rpm離心10 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒開(kāi)始進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE分離總蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。進(jìn)行封閉(5％的脫

5、脂奶粉1h)，隨后開(kāi)始敷抗體，分別加入Gli1抗體(1∶200)和Runx2抗體(1∶1000)，4℃過(guò)夜，然后用TBST將膜洗3遍，每遍5 min，隨后敷羊抗兔二抗(1∶4000)，常溫孵育90 min，再用TBST將膜洗3遍，每遍5min。取出膜，暗室中用ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，曝光，最后采用凝膠成像系統(tǒng)掃描，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　4.ALP活性檢測(cè)
　　待BMSCs傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)，將其接種于24孔板中，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)組

6、要求給予相應(yīng)的干預(yù)措施，培養(yǎng)細(xì)胞7d后，直接將上清吸去后，在培養(yǎng)板中加入適量裂解液充分裂解，裂解30～40min后，用微量移液器吸出液體（可根據(jù)需要用生理鹽水或PBS進(jìn)行一定的稀釋），遵照堿性磷酸酶試劑盒的說(shuō)明書(shū)添加試劑，采用酶標(biāo)法在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP的活性。
　　5.茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色
　　待細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)，將細(xì)胞接種于6孔板中（板中預(yù)先放置24mm×24mm蓋玻片）。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)組要求給予相應(yīng)

7、的干預(yù)措施，在第21d時(shí)收集細(xì)胞，按照茜素紅鈣染色試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。依次予樣本固著、染色和澄清處理，隨后在倒置顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)的染色情況并進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)每組選3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選1個(gè)視野(×100)，計(jì)數(shù)后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)各組間的差異。
　　6.RNA干擾技術(shù)
　　設(shè)計(jì)3條Gli1-siRNA和1條陰性siRNA（non-target siRNA）。整個(gè)過(guò)程均采用無(wú)RNA酶的試劑。轉(zhuǎn)染操作前，需將新買回來(lái)的siRNA凍

8、干粉按說(shuō)明書(shū)配成濃度為20μmol/L的儲(chǔ)存液，分裝置于-20℃冰箱中儲(chǔ)存。待細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第3代時(shí)，將細(xì)胞接種于細(xì)胞至培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至60％～70％時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。根據(jù)siRNA的說(shuō)明書(shū)配制siRNA-Lipofectamine2000混合液。轉(zhuǎn)染6h后，吸走轉(zhuǎn)染液，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠璨煌深A(yù)措施。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

9、，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來(lái)表示，組間比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，在方差齊的情況下，兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Sr上調(diào)BMSCs的Gli1表達(dá)
　　不同濃度Sr(0.1、1、3、5 mmol/L)處理BMSCs7 d后，Gli1蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)，在Sr濃度為0～3 mmol/L范圍內(nèi)呈一定的濃度趨

10、勢(shì)，且Sr濃度為3 mmol/L時(shí)，Gli1蛋白表達(dá)處于峰值;在Sr濃度為5mmol/L時(shí)，Sr對(duì)Gli1蛋白的促進(jìn)作用稍減弱，但仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.01);然而Sr濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，Gli1蛋白表達(dá)則與對(duì)照組無(wú)差異（P＞0.05）。使用3 mmol/L Sr處理BMSCs3 d時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Gli1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異不明顯(P＞0.05)，而處理5d、7d、14d后，Gli1表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05

11、或＜0.01），且在7d時(shí)Gli1蛋白表達(dá)最多。
　　2.Hh受體阻斷劑Cy抑制Sr對(duì)Gli1蛋白的上調(diào)作用
　　3mmol/L Sr處理BMSCs7 d后，Gli1蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。當(dāng)同時(shí)應(yīng)用10μmol/L Cy和3mmol/L Sr處理BMSCs7d后，與單獨(dú)Sr組比較，Gli1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05);然而單獨(dú)使用10μmol/L Cy時(shí)，則對(duì)Gli1蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)明顯影響(P

12、＞0.05)。
　　3.Gli1-siRNA有效鏈的篩選
　　與non-target小干擾RNA(siRNA)組相比較，Gli1-siRNA001未能降低Gli1表達(dá)，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而Gli1-siRNA002及Gli1-siRNA003均能降低Gli1蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，其中Gli1-siRNA002的作用最為明顯(P＜0.01)。
　　4.Gli1-siRNA抑制Sr對(duì)BMSCs Gli

13、1表達(dá)的上調(diào)作用
　　3mmol/L Sr處理BMSCs7 d，Gli1表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01);Gli1-siRNA及non-target siRNA分別轉(zhuǎn)染BMSCs后，再予3mmol/L Sr處理細(xì)胞7d，Gli1-siRNA可以顯著抑制Sr對(duì)Gli1蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用（與單純Sr組比較，P＜0.01），而non-target siRNA組則對(duì)Sr促進(jìn)Gli1蛋白表達(dá)的作用無(wú)明顯影響(與單純Sr組比較，P＞0.0

14、5)。
　　5.Gli1-siRNA抑制Sr對(duì)BMSCs Runx2表達(dá)的上調(diào)作用
　　3mmol/L Sr處理BMSCs7 d，Runx2表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P＜0.01);Gli1-siRNA及non-target siRNA分別轉(zhuǎn)染BMSCs后，再予3mmol/L Sr處理細(xì)胞7d，Gli1-siRNA可以顯著抑制Sr對(duì)Runx2蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用（與單純Sr組比較，P＜0.01），而non-target siRNA

15、組則對(duì)Sr促進(jìn)Runx2蛋白表達(dá)的作用無(wú)明顯影響(與單純Sr組比較，P＞0.05)。
　　6.Gli1-siRNA拮抗Sr對(duì)ALP活性的促進(jìn)作用
　　與對(duì)照組相比，3 mmol/L Sr處理BMSCs7 d明顯增加ALP活性(P＜0.01);Gli1-siRNA及non-target siRNA分別轉(zhuǎn)染BMSCs后，再予3mmol/L Sr處理細(xì)胞7d，Gli1-siRNA可以顯著抑制Sr對(duì)ALP活性的促進(jìn)作用（與單純Sr組

16、比較，P＜0.01），而non-target siRNA組則對(duì)Sr促進(jìn)ALP活性的作用無(wú)明顯影響(與單純Sr組比較，P＞0.05)。
　　7.Gli1-siRNA拮抗Sr對(duì)鈣結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用
　　3mmol/L的Sr處理BMSCs21 d后，可明顯增加鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量（與對(duì)照組比較，P＜0.01）;Gli1-siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后，使Sr對(duì)鈣結(jié)節(jié)形成的促進(jìn)作用受到明顯抑制（與單純Sr組比較，P＜0.01），而non-tar