1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定
　　目的：建立一種體外培養(yǎng)、純化SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的簡(jiǎn)便有效方法，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞來(lái)源。
　　方法：
　　1.取2周純系清潔級(jí)雄性SD大鼠，全骨髓貼壁法培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過體外培養(yǎng)及連續(xù)傳代方法純化、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，利用流式細(xì)胞儀（FCM）鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面膜抗原。
　　

2、3.對(duì)分離培養(yǎng)的細(xì)胞行成骨、成軟骨、成脂肪誘導(dǎo)分化，進(jìn)一步確定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能。
　　結(jié)果：
　　1.取材6h后可見細(xì)胞貼壁，散在分布，3d后貼壁細(xì)胞牢固粘附，細(xì)胞體積增大，顆粒增多，呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，7d后細(xì)胞胞體狹長(zhǎng)，漩渦狀或紡錘狀排列，傳代后，細(xì)胞形態(tài)均一；
　　2.流式細(xì)胞術(shù)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜表面抗原CD90、CD105、 CD73、D34、CD45、CD14陽(yáng)性率分別為99.4％、99.7%、99.

3、6%、2.0%、2.5%、3.5%；
　　3.成骨誘導(dǎo)分化后行茜素紅染色呈現(xiàn)大量橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，成脂肪誘導(dǎo)分化后行油紅 O染色可見胞漿內(nèi)大量鮮紅的脂滴，折光性極強(qiáng)，成軟骨誘導(dǎo)分化后形成質(zhì)地致密的細(xì)胞團(tuán)，阿利新藍(lán)染色可見細(xì)胞內(nèi)大量藍(lán)色基質(zhì)顆粒。
　　結(jié)論：全骨髓貼壁法并連續(xù)傳代法能得到純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是一種簡(jiǎn)便而又有效的分選培養(yǎng)方法。用此方法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好、性狀穩(wěn)定、分化潛能強(qiáng)大，是一種理想的組織工

4、程種子細(xì)胞，并為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定的細(xì)胞來(lái)源。
　　第二部分Wnt通路和Sox9互反饋調(diào)節(jié)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化中的作用
　　目的：通過觀察Wnt通路與Sox9在MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化過程的表達(dá)及關(guān)聯(lián)，并重點(diǎn)研究Wnt通路調(diào)控Sox9表達(dá)調(diào)節(jié)MSCs成軟骨分化的作用及機(jī)制，以及Sox9過表達(dá)反饋調(diào)節(jié)Wnt通路的活性影響MSCs成軟骨分化的作用。從而為更精細(xì)控制MSCs分化，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，豐富再生醫(yī)學(xué)提供理論依據(jù)。

5、r>　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，LiCl刺激干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，CCK-8法觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性以及Western blot檢測(cè)PCNA的表達(dá)情況。
　　2.在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化中，Western blot、RT-qPC檢測(cè)各時(shí)期軟骨指標(biāo)Sox9、Collagen2a、Aggrecan及Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin的表達(dá)情況，并LiCl及Dkk-1分別刺激干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成

6、軟骨誘導(dǎo)分化，重點(diǎn)檢測(cè)早期（第7d）及晚期（第21d）Wnt通路的蛋白表達(dá)及軟骨相關(guān)指標(biāo)的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。
　　3.在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化后期（21d-35d），RT-qPCR檢測(cè)成熟軟骨Collagen2a及肥大指標(biāo)Collagen10、早期成骨分化指標(biāo)RUNX2 mRNA水平，Western blot檢測(cè)β-catenin及Sox9蛋白的表達(dá)。通過LiCl及Dkk-1刺激干預(yù)，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化后

7、期（28d），Western檢測(cè)Collagen2a、Collagen10、RUNX2蛋白等分化指標(biāo)以及Sox9及β-catenin蛋白水平。
　　4.Sox9慢病毒載體陽(yáng)性轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)成軟骨誘導(dǎo)分化過程中Collagen2a、Aggrecan表達(dá)水平，定量測(cè)定分泌型GAG含量，同時(shí)Western blot檢測(cè)Sox9及β-catenin蛋白水平；在成軟骨誘導(dǎo)分化第21天，免疫熒光檢測(cè)Collagen2

8、a表達(dá)情況，Western blot檢測(cè)Wnt通路相關(guān)蛋白GSK-3β、β-catenin、p-β-catenin蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1. LiCl刺激組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，且高表達(dá)PCNA蛋白。
　　2.在成軟骨誘導(dǎo)分化中，Sox9、Collagen2a、Aggrecan的mRNA及蛋白表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，分泌型GAG含量隨著時(shí)間逐漸增高，且在第14d增加顯著，而β-catenin蛋白出現(xiàn)

9、先減少后增加的表達(dá)趨勢(shì)。在成軟骨誘導(dǎo)分化早期（第7d），LiCl促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)增殖相關(guān)蛋白PCNA及Cyclin D蛋白的表達(dá)，而Dkk-1抑制β-catenin蛋白表達(dá)并減少PCNA及Cyclin D蛋白的表達(dá)；在LiCl組Sox9、Collagen2a、Aggrecan蛋白軟骨相關(guān)指標(biāo)表達(dá)，Dkk-1組有相反的結(jié)果。在成軟骨誘導(dǎo)分化晚期（第21d），LiCl組β-catenin蛋白表達(dá)增高而Dkk-1組表達(dá)

10、受抑制，同時(shí)LiCl組阿利新藍(lán)染色明顯增強(qiáng)而Dkk-1組染色減弱；分泌型的GAG含量測(cè)定有相似的結(jié)果；軟骨指標(biāo)Sox9、Collagen2a、Aggrecan mRNA及蛋白測(cè)定顯示LiCl組表達(dá)明顯增高，而Dkk-1組明顯減低。3.在成軟骨誘導(dǎo)分化后期（21d-35d），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Collagen2a表達(dá)逐漸減少，Collagen10及RUNX2 mRNA表達(dá)逐漸增高，而β-catenin蛋白表達(dá)逐漸增多，與Sox9蛋白表達(dá)恰恰

11、相反。在LiCl及Dkk-1干預(yù)下，我們發(fā)現(xiàn)LiCl在促進(jìn)β-catenin蛋白表達(dá)增多的同時(shí)，明顯促使Sox9及Collagen2a蛋白表達(dá)下調(diào)，并上調(diào)Collagen10a及RUNX2蛋白的表達(dá)。
　　4.在對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染Sox9慢病毒后，我們?cè)O(shè)置了Sox9慢病毒轉(zhuǎn)染組。在成軟骨誘導(dǎo)分化中，轉(zhuǎn)染組明顯高表達(dá)Collagen2a及Aggrecan mRNA，分泌型GAG含量測(cè)定也顯示轉(zhuǎn)染組顯著高于對(duì)照組，同時(shí)在Wes

12、tern blot檢測(cè)中，轉(zhuǎn)染組β-catenin蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組。在成軟骨誘導(dǎo)分化第21天，免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染組明顯高表達(dá)Collagen2a，此時(shí)的Western blot檢測(cè)顯示GSK-3β蛋白及β-catenin磷酸化水平增高。
　　結(jié)論：
　　1.LiCl能激活Wnt通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞快速增殖。
　　2.LiCl激活Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin，在成軟骨誘導(dǎo)分化中，早期主要促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)