1、目的：隨著年齡增長，干細(xì)胞和其他成體細(xì)胞一樣，都可發(fā)生衰老變化。已有研究發(fā)現(xiàn)，老年干細(xì)胞微環(huán)境對干細(xì)胞衰老具有促進(jìn)作用，這已經(jīng)成為制約老年患者接受干細(xì)胞移植治療效果的原因之一。但是，目前老年干細(xì)胞微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)衰老的作用及其機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過制備年輕和老年大鼠血清，檢測老年大鼠血清對MSCs衰老、增殖和存活以及Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討wnt/β-catenin信號通路在MSCs衰老、增殖

2、和存活方面的作用及其機(jī)制，為提高老年患者的干細(xì)胞移植療效提供新的思路和可行性依據(jù)。
　　方法：取年輕(8～12周)和老年(64～72周)SD大鼠全血，制備年輕大鼠血清(youngratserum，YRS)和老年大鼠血清(oldratserum，ORS)。分離年輕SD大鼠(8～12周)MSCs。用含20％YRS或ORS的DMEM培養(yǎng)MSCs36h后，SA-β-半乳糖苷酶染色和活性氧(ROS)染色檢測細(xì)胞衰老變化，MTT法檢測細(xì)胞增殖

3、狀態(tài)。用H2O2處理細(xì)胞1h模擬氧化應(yīng)激微環(huán)境，AO/EB染色和Hoechest33342染色檢測MSCs的凋亡，評價不同年齡血清培養(yǎng)條件TMSCs對氧化應(yīng)激的耐受性。用Elisa法檢測年輕和老年血清中Wnt3a含量。通過免疫熒光染色和Westernblotting檢測細(xì)胞內(nèi)wnt/β-catenin信號通路下游信號分子β-catenin和GSK-3β的表達(dá)，RT-PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路靶基因c-myc的表達(dá)，研究

4、ORS對Wnt/β-catenin信號通路的影響。設(shè)計(jì)與合成三條能靶向沉默β-catenin的siRNA(si-β-catenin)，經(jīng)檢測si-β-catenin轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)，篩選有效抑制片段。Westernblotting檢測si-β-catenin轉(zhuǎn)染后不同時間點(diǎn)β-catenin的表達(dá)，確定最佳轉(zhuǎn)染抑制時間。為明確Wnt3a對MSCs衰老的影響，分別在YRS中加入10ng/ml、50ng/ml或100ng

5、/mlWnt3a，采用SA-β-半乳糖苷酶染色觀察不同濃度Wnt3a對細(xì)胞衰老的影響。為進(jìn)一步明確Wnt/β-catenin信號通路對細(xì)胞衰老、增殖、存活的影響，采用DKK1(Wnt/β-catenin信號通路受體阻斷劑)受體水平阻斷Wnt/β-catenin信號通路以及用si-β-catenin干擾其下游信號分子β-catenin，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為四組，分別是YRS、ORS、ORS+DKK1和ORS+si-β-catenin組。SA-β-

6、半乳糖苷酶染色和ROS熒光染色觀察細(xì)胞衰老變化，MTT法檢測細(xì)胞增殖能力，AO/EB染色和Hoechest33342染色觀察細(xì)胞凋亡和存活。通過免疫熒光染色和Westernblotting檢測各組細(xì)胞內(nèi)γ-H2A.X和p53蛋白表達(dá)，RT-PCR法檢測各組細(xì)胞內(nèi)p16INK4a、p53、p21mRNA表達(dá)，探討Wnt/β-catenin信號通路導(dǎo)致MSCs衰老的機(jī)制。
　　結(jié)果：SA-β-半乳糖苷酶染色和ROS熒光染色顯示，ORS

7、處理后衰老細(xì)胞數(shù)量增多，與YRS組比較，差異有顯著性意義。MTT檢測結(jié)果表明，ORS組MSCs的增殖能力較YRS組明顯減弱。在氧化應(yīng)激條件下，ORS組的凋亡和壞死細(xì)胞數(shù)目明顯增加，與YRS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Elisa檢測結(jié)果顯示，ORS中Wnt3a含量明顯高于YRS。用ORS處理36h后，細(xì)胞內(nèi)β-catenin表達(dá)增強(qiáng)，且主要分布于胞核內(nèi)，而GSK-3β的表達(dá)減弱，與YRS組比較，差異有顯著性意義。用DKK1受體阻斷Wnt/

8、β-catenin信號通路后，β-catenin的表達(dá)明顯減弱，而GSK-3β的表達(dá)增強(qiáng)。ORS組細(xì)胞內(nèi)c-mycmRNA的表達(dá)較YRS組明顯增強(qiáng)，而用DKK1處理后，c-mycmRNA的表達(dá)顯著降低。在YRS中加入不同濃度的Wnt3a，觀察對MSCs衰老的影響，結(jié)果顯示10ng/mlWnt3a和50ng/mlWnt3a對細(xì)胞衰老沒有明顯影響，但當(dāng)Wnt3a濃度增加至100ng/ml時，衰老細(xì)胞數(shù)量明顯增加，與YRS組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義。合成的siRNA經(jīng)篩選后確定si-β-catenin2為有效沉默β-catenin的siRNA片段，最佳沉默時間為48h。在ORS培養(yǎng)條件下，用DKK1受體阻斷或si-β-catenin干擾β-catenin表達(dá)后，SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量減少，與ORS組比較差異有顯著性意義。ROS染色結(jié)果顯示，ORS+DKK1組和ORS+si-β-catenin組的ROS陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，熒光強(qiáng)度減弱。用DKK1或si-β-cat

10、enin阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，細(xì)胞的增殖和存活能力較ORS組明顯增強(qiáng)。ORS組細(xì)胞內(nèi)的γ-H2A.X和p53蛋白以及p16INK4a。、p53和p21mRNA表達(dá)明顯升高，與YRS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用DKK1或si-β-catenin阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，γ-H2A.X和p53蛋白以及p16INK4a、p53和p21mRNA的表達(dá)降低。
　　結(jié)論：在體外培養(yǎng)條件下，ORS能促進(jìn)MSCs