1、干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和分化潛能的細胞群體,由于其獨特的生物學特征和功能,已成為現(xiàn)代生物學發(fā)展迅速且廣受關注的領域,干細胞在再生醫(yī)學的應用潛力也日益得到重視。然而,目前制約干細胞推廣應用的瓶頸問題是如何獲得適合臨床應用的干細胞來源和充足的細胞量,如何能夠定向誘導分化。
　　 近年來國外學者從女性經血中分離出間充質干細胞(menstrual blood-derivedmesenchymal stem cells,MMC

2、s),不僅克服了胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESC)來源和倫理之爭,也緩解了骨髓干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs)經創(chuàng)傷途徑獲取和細胞數(shù)量有限的局限性。這種新型干細胞表達干細胞的基本表面標志物,免疫源性低,具有自我更新和多向分化潛能,體外采用特定的誘導劑處理后可以分化為神經元樣細胞,為中樞神經系統(tǒng)疾病的治療帶來希望。然而,國內未見相關研究報道。
　　 干細胞發(fā)育受多條信號

3、通路的共同參與,其中Wnt／β-catenin信號通路通過影響下游靶基因的表達變化調控干細胞的增殖與分化。有研究報道胚胎干細胞、骨髓、臍血問充質干細胞中Wnt／β-catenin信號的存在,可以通過添加外源性Wnt蛋白啟動或通過抑制GSK-3β、APC等信號通路成分的活性間接激活Wnt信號,而在國內外此信號通路如何調控MMCs的生物學行為均未見相關報道。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn),臨床常規(guī)治療躁狂或抑郁癥等精神性疾病的藥物鋰鹽能夠刺

4、激干細胞增殖,當干細胞培養(yǎng)基中添加氯化鋰時,能抑制經典Wnt信號通路中GSK-3β的激酶活性,阻礙GSK-3β介導的β-catenin磷酸化,導致β-catenin的核內積累,進而激活Wnt／β-catenin信號通路。因此,氯化鋰是GSK-3β的抑制劑。
　　 本實驗在成功分離、培養(yǎng)MMCs的基礎上,采用氯化鋰作用于增殖和誘導分化后的MMCs,RT-PCR和western blot分別檢測MMCs中β-catenin的表達量,

5、探索氯化鋰是否通過介導Wnt／β-catenin信號通路調控MMCs的增殖和分化。
　　 本論文共分為三部分,第一部分:MMCs的分離、培養(yǎng)及鑒定；第二部分:體外誘導MMCs神經元樣細胞分化；第三部分:氯化鋰對MMCs中Wnt／β-catenin信號通路成員β-catenin的影響。
　　 第一部分:本課題所用經血均為健康女性志愿者提供。采用Ficoll淋巴細胞分離液,密度梯度離心法收集經血單個核細胞貼壁培養(yǎng),多次換液棄

6、去懸浮生長的血細胞,利用間充質干細胞較單核細胞易脫落的特點,傳代純化擴增細胞；采用CCK-8法測定并繪制細胞增殖曲線；流式細胞術檢測MMCs表面分子標記。實驗結果表明:經血中存在問充質干細胞,且能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)；細胞增殖活力強,P10代與P3代MMCs的增殖速率沒有較大改變；MMCs表達間充質干細胞表面標記如CD29、CD44,不表達造血干細胞標記物CD34和泛白細胞標記物CD45,HLA-ABC低表達,幾乎不表達HLA-DR,說明免疫源

7、性較低；
　　 第二部分:免疫細胞化學檢測MMCs中是否存在神經前體細胞；采用bFGF預誘導24h,β-巰基乙醇和DMSO聯(lián)合誘導MMCs10h向神經元樣細胞分化。用RT-PCR檢測神經干細胞標志物巢蛋白(Nestin)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、神經絲蛋白(NF)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)mRNA的表達情況,并采用免疫細胞化學方法鑒定誘導后MMCs是否表達神經元特異標志基因NSE、NF。結果表明誘導前MMCs出現(xiàn)Ne

8、stin陽性染色,證實MMCs中有神經前體細胞的存在。誘導后MMCs能特異性表達NSE、NF,不表達GFAP,證明誘導后的細胞是神經元細胞,而不是神經膠質細胞。NF、NSE mRNA表達量隨誘導時間的延長逐漸增強,可能與神經元分化的進行有關。
　　 第三部分:在DMEM高糖培養(yǎng)基中分別加入不同濃度(2,4,8,10,20,40mmol／L)的氯化鋰,并持續(xù)處理MMCs4d,進行形態(tài)學觀察:CCK-8法檢測MMCs增殖情況；RT-

9、PCR、western blot分別檢測氯化鋰處理前后MMCs中β-catenin在mRNA和蛋白水平的表達變化；另在神經元誘導培養(yǎng)基中4 mmol／L氯化鋰處理MMCs4d,以檢測MMCs分化后β-catenin基因的表達變化。結果發(fā)現(xiàn)在4d的培養(yǎng)條件下,低濃度氯化鋰(4 mmol／L)促進MMCs增殖,高濃度氯化鋰(10 mmol／L以上)反而抑制MMCs增殖,表明氯化鋰能激活Wnt／β-catenin信號通路,卻存在劑量依賴性。4