1、成體干細(xì)胞的多向分化和自我更新是組織器官再生修復(fù)的基礎(chǔ),然而此生物學(xué)特性易受體內(nèi)炎癥微環(huán)境的影響。喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(laryngeal mucosa mesenchymal stem cells,LM-MSCs)是分離培養(yǎng)喉黏膜獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞,因其與聲帶均發(fā)育于中胚層,且同屬于喉部結(jié)構(gòu),故用于修復(fù)聲帶組織損傷具有巨大潛能。本課題組前期分離、培養(yǎng)和鑒定了 LM-MSCs,并將其注射至激光損傷的聲帶,分別于2w、4w和8w觀察聲帶組織

2、修復(fù)情況,實(shí)驗(yàn)證實(shí),LM-MSCs用于聲帶修復(fù)可以有效的減輕聲帶水腫、瘢痕的形成,且細(xì)胞可在體內(nèi)存活長(zhǎng)達(dá)8w以上,并可向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,表明LM-MSCs可有效修復(fù)聲帶損傷。然而,在臨床手術(shù)切除聲帶病變組織的同時(shí)也會(huì)引起聲帶急性炎癥的形成。急性炎癥對(duì)LM-MSCs生物學(xué)特性的影響勢(shì)必將會(huì)影響LM-MSCs修復(fù)組織損傷的功能。
　　Wnt信號(hào)通路是人體生長(zhǎng)、發(fā)育過程中重要的信號(hào)通路,其在多種疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。Wn

3、t信號(hào)通路主要可分為決定細(xì)胞命運(yùn)的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路和與組織極性及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的非經(jīng)典通路。其中,有研究表明Wnt/β--catenin信號(hào)通路參與了正常及炎癥微環(huán)境下細(xì)胞增殖、分化能力的調(diào)控。在炎癥微環(huán)境牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化能力下降,用Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑DKK1下調(diào)通路,可部分或全部逆轉(zhuǎn)PDLSCs的成骨分化

4、能力。
　　綜上,我們?cè)隗w外模擬炎癥微環(huán)境并探討其對(duì)LM-MSCs成脂、成骨和成肌多向分化能力的影響,考慮聲帶組織的特殊性,我們重點(diǎn)研究炎癥微環(huán)境對(duì) LM-MSCs成肌分化能力的影響。并用Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑或激活劑調(diào)控通路,以期恢復(fù)炎癥微環(huán)境中LM-MSCs的成肌分化能力。
　　研究目的:
　　探討炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs多向分化能力如成骨、成脂及成肌分化能力的影響,揭示炎癥條件下Wnt/β-

5、catenin的變化作用規(guī)律,通過在Wnt/β-catenin信號(hào)通路分子水平上進(jìn)行調(diào)控,以期恢復(fù)炎癥微環(huán)境中LM-MSCs肌向分化能力,最終促進(jìn)LM-MSCs修復(fù)聲帶組織損傷及組織再生。
　　研究方法:
　　1.LM-MSCs分離培養(yǎng)、鑒定與多向分化能力的研究:用消化法分離培養(yǎng)會(huì)厭舌面黏膜組織獲得LM-MSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD105,CD90,CD44,CD34,CD14和CD31表達(dá)情況;將細(xì)胞向成

6、骨誘導(dǎo)分化21d后行茜素紅染色,鑒定其成骨分化能力;將細(xì)胞向成脂細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化14d后行油紅O染色,鑒定其成脂分化能力;將細(xì)胞向成肌細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化1w、3w和6w后,行免疫熒光化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量檢測(cè)(RT-PCR)檢測(cè)其成肌分化能力。
　　2.炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs多向分化能力的影響:用10ng/ml的TNF-α和5ng/ml的IL-1β在體外模擬炎癥微環(huán)境,將細(xì)胞在炎癥和正常微環(huán)境分別向成骨、成脂和成肌方向誘導(dǎo)分化,在成

7、骨誘導(dǎo)分化后的7d和21d分別行堿性磷酸酶(ALP)染色和茜素紅染色,并將生成的礦化結(jié)節(jié)溶解下來行定量檢測(cè);在成脂誘導(dǎo)分化14d行油紅O染色,并將脂滴溶解下來行定量檢測(cè);在成肌誘導(dǎo)分化的1w、3w和6w提取細(xì)胞蛋白和基因,用RT-PCR和Western Blot蛋白印跡檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)成肌初始基因和蛋白Myod1、成肌分化標(biāo)志性基因和蛋白Myogenin(Myog)和成肌分化終末基因和蛋白 myosin heavy chain（MyHc)表

8、達(dá)情況;并檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子GSK3β、P-GSK3β和β-catenin蛋白和基因表達(dá)情況,以檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在炎癥微環(huán)境LM-MSCs成肌分化過程中所處的狀態(tài)。
　　3.Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)炎癥微環(huán)境中LM-MSCs肌向分化能力的調(diào)控:體外實(shí)驗(yàn)中,分別用DKK1下調(diào)炎癥微環(huán)境和Wnt3a上調(diào)正常微環(huán)境中LM-MSCs成肌分化過程中Wnt/β-cateni

9、n信號(hào)通路,并檢測(cè)成肌分化相關(guān)蛋白和基因表達(dá)情況;按體外實(shí)驗(yàn)分組情況制備成肌分化的細(xì)胞膠原團(tuán)塊,并將其移植至裸鼠皮下2w,取出移植物,行 HE染色觀察組織學(xué)行為,Masson三色染色和觀察細(xì)胞成肌分化情況,行免疫熒光化學(xué)染色觀察成肌分化相關(guān)蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.LM-MSCs分離培養(yǎng)、鑒定與多向分化能力的研究:用消化法分離培養(yǎng)會(huì)厭舌面黏膜組織,可獲得LM-MSCs,其可貼壁生長(zhǎng),呈長(zhǎng)梭形,陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表

10、面分子標(biāo)志CD105(94.2％),CD90(99.5%)和CD44(99.8%),不表達(dá)造血系和內(nèi)皮細(xì)胞系干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34(0.6%),CD14(0.7%)和CD31(0.5%)。細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化21d并行茜素紅染色,可見細(xì)胞中有礦化結(jié)節(jié)著紅色;細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)分化14d后并經(jīng)油紅O染色后,可見細(xì)胞中串珠樣脂滴紅染;將細(xì)胞向成肌細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化1w、3w和6w后,行免疫熒光化學(xué)染色和RT-PCR檢測(cè)成肌相關(guān)基因和蛋白表達(dá)情況,

11、可見初始基因和蛋白Myod1和成肌分化特異性標(biāo)志蛋白和基因Myog于成肌誘導(dǎo)分化后1w開始表達(dá),并可持續(xù)表達(dá)于成肌誘導(dǎo)分化6w,成肌分化終末標(biāo)志蛋白和基因MyHc于成肌誘導(dǎo)分化3w時(shí)表達(dá),持續(xù)表達(dá)于成肌誘導(dǎo)分化6w。
　　2.炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs多向分化能力的影響
　　2.1、炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs成骨分化能力影響:炎癥和正常微環(huán)境中將LM-MSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并分別行 ALP染色、茜素紅染色,結(jié)果可見,細(xì)

12、胞在炎癥和正常微環(huán)境中成骨誘導(dǎo)分化7d后ALP染色均可著藍(lán)染,而炎癥微環(huán)境下細(xì)胞著色淺;成骨誘導(dǎo)分化21d后行茜素紅染色,可見炎癥微環(huán)境下細(xì)胞著紅染色礦化結(jié)節(jié)少于正常微環(huán)境,表明炎癥微環(huán)境抑制LM-MSCs骨向分化。
　　2.2、炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs成脂分化能力影響:炎癥和正常微環(huán)境中將細(xì)LM-MSCs向成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并于誘導(dǎo)分化14d后行油紅O染色,炎癥和正常微環(huán)境LM-MSCs脂向分化過程中均有脂滴生成,而炎癥微環(huán)境

13、中串珠樣脂滴形成較少,表明炎癥微環(huán)境抑制LM-MSCs脂向分化。
　　2.3、炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs成肌分化能力影響:炎癥和正常微環(huán)境中將LM-MSCs向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化,并分別于誘導(dǎo)分化后1w、3w和6w提取細(xì)胞基因和蛋白,行 RT-PCR和Western Blot檢測(cè)成肌相關(guān)蛋白和基因,可見炎癥微環(huán)境中LM-MSCs肌向分化過程中成肌分化相關(guān)蛋白和基因均較對(duì)照組表達(dá)量降低。
　　3.Wnt/β-catenin信號(hào)通路

14、對(duì)炎癥微環(huán)境中LM-MSCs肌向分化能力的調(diào)控
　　3.1、體外實(shí)驗(yàn):分別用DKK1下調(diào)炎癥微環(huán)境和Wnt3a上調(diào)正常微環(huán)境中LM-MSCs成肌分化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路,并檢測(cè)成肌分化相關(guān)蛋白和基因表達(dá)情況,可見經(jīng)DKK1干預(yù)后炎癥微環(huán)境中LM-MSCs成肌相關(guān)蛋白和基因表達(dá)量較炎癥組增高,加入Wnt3a上調(diào)正常微環(huán)境中LM-MSCs成肌分化,可見成肌相關(guān)蛋白和基因表達(dá)量與炎癥組都較正常減弱,表明下調(diào)Wnt/β

15、-catenin信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs成肌分化的抑制作用,而上調(diào)通路則可抑制正常微環(huán)境中LM-MSCs的成肌分化。
　　3.2、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):按體外實(shí)驗(yàn)分組情況制備成肌分化的細(xì)胞膠原團(tuán)塊,并將其移植至裸鼠皮下2w,取出移植物,行HE染色觀察組織學(xué)行為,Masson三色染色和觀察細(xì)胞成肌分化情況,行免疫熒光化學(xué)染色觀察成肌分化相關(guān)蛋白表達(dá)情況,其結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)炎

16、癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs成肌分化的抑制作用,而上調(diào)通路則可抑制正常微環(huán)境中LM-MSCs的成肌分化。
　　結(jié)論:
　　1.炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs成骨分化能力影響:LM-MSCs屬于間充質(zhì)干細(xì)胞,具有向成骨、成脂及成肌細(xì)胞方向分化的能力。
　　2.炎癥微環(huán)境對(duì) LM-MSCs多向分化能力的影響:炎癥微環(huán)境對(duì)LM-MSCs成骨、成脂及成肌細(xì)胞分化均具有抑制作用。
　　3.Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)炎癥微