1、目的：(1)分離、培養(yǎng)及鑒定骨髓源性間充質(zhì)干細胞(Bone MarrowMesenchymal Stem Cells，BMSCs)，并獲取高純度的BMSCs；(2)分離、培養(yǎng)及鑒定關節(jié)軟骨細胞(Articular Cartilage Cells，ACs)，并獲取高純度的ACs；(3)BMSCs與ACs共同培養(yǎng)誘導，并檢測其誘導結果；(4)對共培養(yǎng)生物誘導與TGF-β1化學誘導的結果進行比較。
　　 方法：(1)獲取并培養(yǎng)、增殖高

2、純度骨髓間充質(zhì)干細胞：從SD大鼠(4周齡)的股骨及脛骨干中取得骨髓，聯(lián)合利用密度梯度離心法及差異貼壁法分離、純化BMSCs，體外擴增并傳代后，相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及流式細胞儀檢測細胞表面標記：CD29、CD90、CD34及CD45，再通過成脂肪樣、成骨樣及成神經(jīng)樣細胞多向分化誘導，檢測其誘導結果，確定所得細胞為BMSCs，為下一步實驗打下基礎。(2)獲取并培養(yǎng)、增殖高純度的關節(jié)軟骨細胞：從SD大鼠(4周齡)的正常股骨頭表面取得關節(jié)

3、軟骨片，先后運用0.25％的胰蛋白酶和0.2％Ⅱ型膠原酶消化軟骨片，當相差顯微鏡下見有大量軟骨細胞游離后，離心、棄上清液，加入含15％FBS的軟骨細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)、擴增傳代，并取樣行臺盼藍染色計數(shù)。當細胞傳至第三代時，運用甲苯胺藍染色及HE染色檢查、鑒別該細胞，確定所得細胞為關節(jié)軟骨細胞，為下一步實驗打下基礎。(3)BMSCs與ACs在Transwell共培養(yǎng)：分別吸取第三代BMSCs和ACs，按1∶1的細胞比例分別植于Transwe

4、ll共培養(yǎng)系統(tǒng)中，下室植入BMSCs，上室植入ACs，同時設置相同濃度單獨BMSCs空白對照組，分別在用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細胞的增殖和基質(zhì)合成情況，并對各組細胞爬片進行Ⅱ型膠原免疫組化染色檢查。(4)共培養(yǎng)生物誘導與TGF-β1化學誘導的比較：將BMSCs用于TGF-β1(10 ng/m1)誘導，同時與1∶2，1∶1，2∶1(關節(jié)軟骨細胞：BMSCs)濃度的細胞共培養(yǎng)誘導組比較對照。并運用MTT比色

5、法檢查、氨基聚糖(GAG)含量檢測及WESTERN BLOT檢測各組細胞Ⅱ型膠原基因表達量，確定其誘導情況。
　　 結果：(1)獲取并培養(yǎng)、增殖高純度BMSCs：相差顯微鏡下觀察結果：原代細胞接種12h后可見部分細胞貼壁，24h后細胞大量貼壁，外觀呈現(xiàn)紡錘形或多角形。72h后細胞數(shù)量開始增多，大部分細胞形態(tài)呈長梭形、似成纖維細胞。培養(yǎng)10d左右細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底達80％左右，細胞呈極性排列，部分集落可呈漩渦狀。細胞表面標記物經(jīng)流式

6、細胞儀檢測結果：BMSCs均一地表達CD29及CD90，陽性率分別為92.5％及94.4％；而CD34和CD45為陰性，陰性率分別為99.3％和99.7％。成脂肪樣、成骨樣及成神經(jīng)樣細胞誘導均獲得成功。(2)獲取并培養(yǎng)高純度的ACs：運用上述方法可獲得一定純度的ACs。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：軟骨細胞接種12h后開始貼壁，48h完成貼壁。原代培養(yǎng)的ACs呈圓形及多角形，胞漿豐富，胞核圓形，居中，細胞長成一片可呈明顯的鋪路石樣外觀，與

7、長梭形的成纖維細胞較易區(qū)分。試驗證明：經(jīng)本方法消化培養(yǎng)后僅見單一的軟骨細胞生長。(3)BMSCs與ACs共培養(yǎng)：共培養(yǎng)組BMSCs數(shù)量增多，細胞外基質(zhì)合成豐富，其基質(zhì)能被Ⅱ型膠原免疫組化染色，細胞染色呈現(xiàn)黃色。(4)共培養(yǎng)生物誘導與TGF-β1化學誘導的比較：共培養(yǎng)細胞生物誘導的MTT比色法檢查、氨基聚糖(GAG)含量檢測及Ⅱ型膠原WESTERN BLOT檢測結果顯示：各組細胞共培養(yǎng)誘導結果均不差于TGF-β110ng/m的1化學誘導結