1、本論文通過從全國各地進行廣泛采樣，分離和篩選出磷脂酶C(phospholipaseC，簡稱PLC)產(chǎn)量高、抗血小板功能強的微生物菌種，在此基礎(chǔ)上對其進行種類鑒定，同時，還對產(chǎn)酶條件以及所產(chǎn)磷脂酶C的理化特性進行了研究，從而為今后將磷脂酶C研制開發(fā)成抗血小板聚集一類新藥打下堅實的實驗基礎(chǔ)。 一、本研究采用的主要方法如下： 1．菌種分離采用卵黃瓊脂LB平板分離法； 2．菌種篩選采用卵黃硼砂平板酶活定性檢測、菌體生物量

2、和用對硝基磷酸膽堿(p-nitrophehylphosphoryl-choline，簡稱NPPC)作為磷脂酶C的作用底物進行酶活定量檢測以及抗血小板聚集率等多指標多輪次篩選。 3．菌種的分類鑒定采用菌株的個體形態(tài)學特征和群體形態(tài)學特征、生理生化特性及16s rRNA序列等依據(jù)進行。 4．培養(yǎng)條件的優(yōu)化實驗采用正交實驗方法。主要考慮培養(yǎng)基、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及搖床轉(zhuǎn)速等對磷脂酶C產(chǎn)酶活水平的影響。 5．磷脂

3、酶C分子量測定采用不連續(xù)SDS-PAGE法。 6．磷脂酶c酶活力測定采用卵黃硼砂平板法和NPPC法。 7．磷脂酶C溶血活性測定采用血平板法。 二、主要實驗結(jié)果如下： 1．從1268份土樣中篩選獲得了4株新的高產(chǎn)磷脂酶C優(yōu)良菌株，分別將其分類鑒定為：Bacillus cereus Shenzhen 754-1、B．mycoides Shenzhen 779、B．mycoidesShenzhen 970和B.

4、 mycoides Shenzhen 1107。 2．B．cereus Shenzhen 754-1搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)磷脂酶c的最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.3％牛肉膏)，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時間12h，接種量0．5％，轉(zhuǎn)速200r/min。在此培養(yǎng)條件下，B．cereus Shenzhen 754-1磷脂酶C的產(chǎn)酶水平達到26U/ml。 3．純化的磷脂酶C樣品分子量為75100 Da，對熱較敏感，70℃水浴處理5mi