1、哈氏噬纖維菌(Cytophaga hutchinsonii)是一類廣泛分布的降解纖維素細菌，由于其能獨特的高效降解結(jié)晶纖維素而被美國能源部列入微生物基因組研究計劃，并于2005年完成了全基因組序列的測定。 哈氏噬纖維菌雖然能在貧瘠的環(huán)境中迅速徹底地降解結(jié)晶纖維素，但是卻不易在葡萄糖碳源瓊脂平板上生長，生長條件特殊，能利用的可溶性碳源范圍狹窄，所以對其纖維素降解機制的研究主要停留在表面現(xiàn)象，一直很難深入研究。本論文通過利用單獨滅菌

2、或過濾除菌的葡萄糖做碳源，降低瓊脂濃度的方法，使哈氏噬纖維菌在瓊脂平板上生長條件得到改善。哈氏噬纖維菌在0.5％agar,0.22μm微孔濾膜過濾或者115℃，30min高壓滅菌的葡萄糖為碳源的平板上能夠長出單菌落。這為哈氏噬纖維菌的下一步研究提供了有利條件。 本論文優(yōu)化了哈氏噬纖維菌的遺傳轉(zhuǎn)化操作系統(tǒng)，對多個影響哈氏噬纖維菌遺傳操作的因素進行了探索。在接合的過程中，感受態(tài)細胞的制備是一個關(guān)鍵因素，滲透壓，接合的時間和溫度都影響

3、轉(zhuǎn)化效率。以對數(shù)中期的細胞為感受態(tài)細胞，生理鹽水或者 TC buffer 洗滌細胞，28℃接合24h，轉(zhuǎn)化效率達到1.5×10-6左右。這種接合方式是建立在優(yōu)化了平板生長條件的基礎(chǔ)上，克服了在濾紙上生長的局限性，能得到大量的突變子。本論文利用轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機插入突變建立了一個突變子庫。目前大約有1000個菌株。 對纖維素的高效降解是哈氏噬纖維菌的一個明顯特征，本論文根據(jù)該菌在葡萄糖和纖維素平板上生長現(xiàn)象的不同，設(shè)計了一種混

4、合碳源篩選平板(0.05％GLUCOSE+1％CF-11)，根據(jù)透明圈的大小或不產(chǎn)透明圈可以篩選得到纖維素降解能力減弱或不能降解纖維素的菌株。另外發(fā)現(xiàn)0.05％葡萄糖的添加也促進了哈氏噬纖維菌的生長，該方法減少了傳統(tǒng)缺陷菌株篩選方法的煩瑣過程，提高了篩選效率。 根據(jù)是否降解纖維素，CMC酶活測定和完全降解濾紙的時間等方法發(fā)現(xiàn)兩株纖維素降解能力降低的菌株27號和31號突變子。其中27號突變子酶活降低20.7％，濾紙降解時間比哈氏噬

5、纖維菌慢一個星期左右。通過DNAMAN，BLAST等軟件對其進行了序列分析，發(fā)現(xiàn)27號突變子屬于還未確定功能的蛋白的插入失活體，該蛋白在纖維素降解中是否起作用以及如何起作用，還需進一步實驗證明。31號突變子酶活降低40.7％，濾紙降解時間比哈氏噬纖維菌慢13天左右。通過DNAMAN，BLAST等軟件對其進行了序列分析，發(fā)現(xiàn)31號突變子屬于還未確定功能的蛋白的插入失活體，預(yù)測是一種分泌性蛋白，是否是哈氏嗜纖維菌纖維素酶系的組成部分之一還有

6、待于驗證。 滑動性是哈氏噬纖維菌的另一個重要特性，也是本論文篩選的突變子特性之一。 本論文篩選得到兩株滑動性增強的突變子39號和212號突變子，其中39號突變子從表觀現(xiàn)象上看，CMC內(nèi)切酶活升高25.08％，從而從一方面表明哈氏噬纖維菌的多糖利用與其滑動性相關(guān)。39號突變子屬于一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的失活突變體。其滑動現(xiàn)象類似于粘細菌的S型滑動。212號突變子能夠降解濾紙。212號突變子屬于DNA解旋酶超家族I失活突變體。21