1、四川大學(xué)博士學(xué)位論文牛蛙生長(zhǎng)激素基因克隆及其表達(dá)效應(yīng)研究姓名：龍章富申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：劉世貴20030430叫川人學(xué)博I學(xué)位論文Takahashi等(1992)報(bào)道的牛蛙GH蛋白序列(AAB24792)的同源性為97％，與Kobalyashi等(1991)報(bào)道的牛蛙GH蛋白序歹mJ(AABl9428)的同源性為95％。本研究克隆的牛蛙生長(zhǎng)激素基因BfGH已在GenBank登記(AY251538)。采用雙酶切牛蛙GH

2、基因cDNA片斷和原核表達(dá)載體pGEXl一九T，將BfGHcDNA定向插入到pGEXlXT，經(jīng)酶切鑒定后進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)研究。表達(dá)研究結(jié)果包括三方面，一是重組pGBfGH在大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白分子量為509KDa，符合推導(dǎo)分析的預(yù)期大小；二是誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，在添加ImM／LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)3hrs就能得到高效表達(dá)，經(jīng)定量分析，牛蛙生長(zhǎng)激素基因在大腸桿菌中的表達(dá)量可達(dá)到菌體總蛋白的293％；通過(guò)比較不同誘導(dǎo)時(shí)問(wèn)和不同濃度的誘導(dǎo)劑用

3、量等研究，結(jié)果表明在IPTG濃度為0ImM／L時(shí)，37℃誘導(dǎo)表達(dá)4hrs，其表達(dá)量與1mM／L濃度的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達(dá)3hrs的表達(dá)量一致，這為大量表達(dá)生產(chǎn)重組牛蛙GH蛋白時(shí)降低IPTG用量、從而降低生產(chǎn)成本提供了理論依據(jù)。三是重組BfGH在大腸桿菌中的表達(dá)以形成包涵體的形式存在。通過(guò)回收原核表達(dá)的牛蛙GH重組蛋白(reBfGH)，并制各抗B好H的兔抗高免血清，采用牛蛙肝受體膜蛋白為吸附受體，以回收的重組牛蛙生長(zhǎng)激素融合蛋白為抗原

4、，兔抗BfGH高免血清為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)羊抗兔IgG(HRP—IgG)為二抗，進(jìn)行ELISA—RA檢測(cè)，驗(yàn)證了回收的重組牛蛙生長(zhǎng)激素融合蛋白具有較強(qiáng)的生物活性和免疫活性。以VRl020為載體，構(gòu)建了牛蛙GH真核表達(dá)質(zhì)粒VBfGH、草魚(yú)GH真核表達(dá)質(zhì)粒VgcGH，并以脂質(zhì)體為載體進(jìn)行了Cos7細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染2472hrs后，對(duì)抽提的轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA進(jìn)行RTPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染24hrsVBfGH在Cos7細(xì)胞中即有轉(zhuǎn)錄，并

5、在72hrs時(shí)轉(zhuǎn)錄量最強(qiáng)；以轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)液為抗原進(jìn)行ELISARA檢測(cè)。轉(zhuǎn)染24hrs、48hrs、72hrs的牛蛙生長(zhǎng)激素表達(dá)量分別為2540ng／ml，5867ng／ml和7347ng／r01。為進(jìn)一步驗(yàn)證牛蛙重組生長(zhǎng)激素蛋白和真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達(dá)對(duì)牛蛙的生物活性，進(jìn)行脂質(zhì)體包裹重組reBfGH蛋白、脂質(zhì)體包裹VBfGH質(zhì)粒、脂質(zhì)體包裹草魚(yú)GH真核表達(dá)質(zhì)粒VgcGH、脂質(zhì)體包裹VRl020質(zhì)粒對(duì)牛蛙體內(nèi)促長(zhǎng)效果的比較研究，并以脂質(zhì)體