豬生長(zhǎng)激素基因的克隆及在COS-7細(xì)胞的表達(dá)研究.pdf_第1頁(yè)
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1、本研究以長(zhǎng)白豬垂體總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR克隆了豬生長(zhǎng)激素(pGH)基因編碼區(qū)cDNA。1.0％瓊脂糖電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，膠回收PCR產(chǎn)物并通過(guò)T-A法亞克隆到pMD18-T載體中轉(zhuǎn)化到DH5αE.coli，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后進(jìn)行序列分析。序列分析表明，克隆得到的豬生長(zhǎng)激素基因pGH編碼216個(gè)氨基酸殘基，分子量為24.4KDa，等電點(diǎn)為7.26；疏水氨基酸44.9％，親水氨基酸30.6％，堿性氨基酸13.0％，酸性氨基

2、酸11.6％。其1-26aa為pGH信號(hào)肽序列，27-216aa為成熟肽序列。pGH與Seeburg等(1983)報(bào)道的豬GH蛋白序列(AAA31045)的同源性為100％，與Kato等(1990)報(bào)道的豬GH相比在蛋白質(zhì)序列(CAA37411)有99.1％的同源性，與Qi等(1989)和Chowdhary等(1994)報(bào)道的豬GH蛋白序列(AAA73477，NP999034)的同源性為97.7％，與Qi等(1989)報(bào)道的豬GH蛋白序

3、列(AAA73478)的同源性為97.2％。　　將已克隆的豬生長(zhǎng)激素(pGH)基因cDNA片斷定向插入VR1020質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，用菌落PCR和質(zhì)粒PCR方法篩選陽(yáng)性克?。灰訠amHI和EcoRI酶切鑒定重組真核表達(dá)質(zhì)粒VpGH。利用脂質(zhì)體法介導(dǎo)VpGH轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7，對(duì)轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR、ELISA和免疫熒光分析，分別在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平證實(shí)了目的基因在COS-7細(xì)胞中得到正確轉(zhuǎn)染表達(dá)。本研究

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