1、外周血免疫相關(guān)細(xì)胞及其分泌的功能分子，在免疫調(diào)節(jié)、抗微生物、抗腫瘤以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。脂多糖(LPS)和刀豆素A(ConA)作為絲裂原能激活淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌一些細(xì)胞因子，這些因子的分泌受一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，該網(wǎng)絡(luò)是由許多分子組成和參與。為篩選和發(fā)現(xiàn)一些新的免疫相關(guān)候選分子，研究其結(jié)構(gòu)和功能以及參與免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)構(gòu)建了經(jīng)ConA和LPS聯(lián)合刺激誘導(dǎo)的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，并篩選、

2、克隆和鑒定分析了重要功能基因。 本研究以牦牛外周血單個(gè)核細(xì)胞為材料，以誘導(dǎo)刺激細(xì)胞的RNA合成的cDNA為試驗(yàn)組，以未經(jīng)誘導(dǎo)刺激的cDNA為對(duì)照組，經(jīng)消減雜交和抑制性PCR擴(kuò)增，將其產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，構(gòu)建了牦牛外周血單個(gè)核細(xì)胞消減cDNA文庫(kù)。從文庫(kù)中挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR鑒定，其插入片段在200～1000bp之間。隨機(jī)選擇非重復(fù)的6個(gè)有效EST序列，以半定量PCR方法驗(yàn)證其消減效率，

3、結(jié)果顯示均從消減文庫(kù)中擴(kuò)增到目的片段，其中5個(gè)為誘導(dǎo)性差異表達(dá)分子，1個(gè)為誘導(dǎo)特異性表達(dá)分子，說(shuō)明該文庫(kù)有較高的質(zhì)量。文庫(kù)中有效EST序列的測(cè)序和生物信息學(xué)分析表明，初步獲得27條差異表達(dá)基因片段，其中3個(gè)克隆為未知功能的新基因片段序列，其余的克隆涉及蛋白質(zhì)合成、翻譯和表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞間通信、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞和機(jī)體防御、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等功能分子，這些分子的克隆和發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物宿主分子免疫學(xué)創(chuàng)新性研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究選擇文庫(kù)

4、中與趨化因子受體4(CXCR4)和胸腺素a原(ProTα)高度同源的兩個(gè)分子片段為研究對(duì)象。根據(jù)牛趨化因子受體4(CXCR4)和胸腺素α原(ProTα)全長(zhǎng)基因設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增、克隆和鑒定趨化因子受體4(CXCR4)和胸腺素α原(ProTa)這兩個(gè)與免疫和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)重要功能分子。DNA測(cè)序及其序列分析表明，克隆的CXCR4基因的開放閱讀框?yàn)?062 bp，編碼353氨基酸殘基的前體蛋白，與登錄的CXCR4基因cDNA序列同源性