1、為研究干出脅迫條件下孔石莼(Ulva pertusa)相關(guān)功能基因的差異表達(dá)情況，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬干出脅迫狀態(tài)，以處理后的孔石莼為檢測(cè)方(Tester)，以正常生長(zhǎng)(對(duì)照組)的孔石莼為對(duì)照方(Driver)，利用抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)技術(shù)構(gòu)建了孔石莼在干出脅迫下上調(diào)表達(dá)基因的消減cDNA文庫(kù)。
　　 從孔石莼的消減cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取160個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)

2、序，共得到可以利用的EST片段是150條，它們占到總測(cè)序樣品的93.8％。其中有21條為冗余序列(Redundantsequence，RS)，137條為非冗余序列(Non-redundant sequence，NRS)且全為獨(dú)立的EST片段(Singleton)。通過(guò)軟件分析和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，片段長(zhǎng)度都集中在100～900bp間，平均長(zhǎng)度為364bp。根據(jù)這些ESTs推導(dǎo)出的多肽序列與已知功能蛋白的氨基酸序列的相似度主要集中在20％～60

3、％之間。其中，通過(guò)選取比對(duì)的22條EST序列發(fā)現(xiàn)，它們與已經(jīng)完成基因組測(cè)序的高等植物及藻類(lèi)的氨基酸序列相比有較高的相似性。獲得的EST片段按其功能注釋主要分為以下幾大類(lèi)：與細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)，占22.63％；與蛋白合成及分解相關(guān)，占5.84％；與代謝相關(guān)，占7.30％；與脅迫應(yīng)答相關(guān)，占5.11％；與光合作用和光誘導(dǎo)相關(guān)，占5.11％；與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)，占3.65％；與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，占6.57％；未知功能，占24.09％；無(wú)對(duì)比結(jié)果，占1

4、9.71％；未知功能和無(wú)對(duì)比結(jié)果的序列共60條，占非冗余序列的43.80％，比例較高。對(duì)22條EST序列的密碼子偏好性預(yù)測(cè)分析，計(jì)算結(jié)果顯示孔石莼對(duì)密碼子第三位各堿基的使用偏好無(wú)顯著差異(P>0.05)，GC使用總頻率為50.66％，在所分析的序列中，孔石莼終止密碼子明顯偏好 TGA。
　　 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTq-PCR)技術(shù)對(duì)八氫番茄紅素

5、脫氫酶紅素脫氫酶(Phytoene desaturase，PDS)、鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)、14-3-3蛋白(14-3-3-like protein，1433s)及滲透活化蛋白激酶(Osmotic stress-activatedprotein kinase，OSAK)在干出脅迫處理前后的表達(dá)量差別進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，這些基因表達(dá)量均隨處理時(shí)間的增加而呈上調(diào)趨勢(shì)。說(shuō)明這些基因的表達(dá)調(diào)控在孔石莼抵御潮間帶干出脅迫的分子響應(yīng)