1、首先該研究分別從中華蜜蜂、意大利蜜蜂工蜂和雌性亞非馬蜂、額斑黃胡蜂、墨胸胡蜂、大胡蜂毒腺中抽提總RNA,通過RT-PCR方法擴(kuò)增得到2種蜜蜂和4種胡蜂蜂毒前溶血肽原的cDNA,再將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pGEM-Teasy vector上.以前胡蜂總科被認(rèn)為不存在溶血肽基因,該研究首次揭示了胡蜂總科存在與蜜蜂相似的溶血肽基因.該文報(bào)道的中華蜜蜂、亞非馬蜂、額斑黃胡蜂、墨胸胡蜂和大胡蜂的前溶血肽原基因都已作為新的基因序列在GenBank登錄,利用

2、GST基因融合表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了中華蜜蜂、亞非馬蜂溶血肽基因的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)載體pGEX-AccM和pGEX-PhM,并在菌株BL21中進(jìn)行了高效表達(dá).二者的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Wesiern blotting檢測(cè)均具有很強(qiáng)的免疫活性,與預(yù)期目的蛋白分子量大小一致,三抗夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果也表明表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的免疫學(xué)活性.表達(dá)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明pGEX-PhM和pGEX-AccM在IPTG誘導(dǎo)下都能夠在大腸桿菌BL21中穩(wěn)定高效表達(dá).二者的表達(dá)

3、產(chǎn)物經(jīng)Western blotting檢測(cè)均具有很強(qiáng)的免疫活性,與預(yù)期目的蛋白分子量大小一致,三抗夾心ELISA檢測(cè)結(jié)果也表明表達(dá)產(chǎn)物具有明顯的免疫學(xué)活性.我們還將中華蜜蜂和亞非馬蜂溶血肽基因與增強(qiáng)型熒光(GFPT)基因融合在桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá),二者的表達(dá)量分別占Tn細(xì)胞總蛋白的3.1﹪和2.6﹪.Westernblotting顯示表達(dá)產(chǎn)物對(duì)His-Tag MonoclonalAntibody和兔抗溶血肽(與卵清蛋白

4、交聯(lián)的總蛋白)多克隆抗體都具有良好的免疫活性,在約34.6kD處均有一明顯的條帶,與預(yù)期目的蛋白的分子量大小一致.感染Bacmid-GFPTAccM和Bacmid-GFPTPhM的Tn細(xì)胞與感染陰性對(duì)照Bacmid的Tn細(xì)胞狀態(tài)相比,其感染癥狀并沒有明顯區(qū)別,說明表達(dá)產(chǎn)物-融合蛋白GFPTAccM和GFPTPhM對(duì)細(xì)胞也不具明顯的毒性.同時(shí)我們也分別構(gòu)建了中華蜜蜂、亞非馬蜂和額斑黃胡蜂前溶血肽原基因與增強(qiáng)型熒光(GFPT)基因和HisT