1、由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的黃萎病是棉花的主要病害之一,它嚴重影響了棉花的生產(chǎn)。本實驗室武翠紅碩士分離篩選出了一株對大麗輪枝菌有較強抗菌活性的新菌株一解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)RS-25,對此菌株的蛋白進行了分離純化,得到表觀分子量為9 kD的單一活性組分,命名為A2,EDMAN降解法測得其N端序列為ASGGTVGIYGANMRS。本論文在此工作基

2、礎上進行后續(xù)研究,重點研究了棉花黃萎病抗菌肽全長基因和成熟肽基因的克隆及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達。
　　 將A2的N端15個氨基酸在NCBI上進行比對,結合菌株的16S rDNA結果,得到一段100％同源蛋白序列。根據(jù)此同源蛋白對應的編碼序列對新型抗菌肽全長基因進行引物設計,構建重組質(zhì)粒pET-30a-a2q1,并對其進行了測序。結果表明:此抗菌肽基因a2q1全長354 bp,編碼117個氨基酸,其中第42～56位氨基酸與武

3、分離純化的抗菌肽A2的N端15個氨基酸完全相同。本研究得到的蛋白在N端比抗菌肽A2多出41個氨基酸,分析這41個氨基酸可能起調(diào)控作用,而武分離純化的抗菌肽A2為成熟肽。將重組質(zhì)粒pET-30a-a2q1利用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,IPTG誘導后,SDS-PAGE顯示胞內(nèi)具有目的條帶,表達產(chǎn)物表觀分子量為19 kD。用鎳柱親和層析的方法對表達蛋白進行純化,SDS-PAGE顯示在19 kD有單一條帶。大麗輪枝菌抑菌試驗檢測,發(fā)現(xiàn)其無

4、抑菌活性。本研究克隆表達的目的蛋白A2Q1比武分離純化的抗菌肽A2多41個氨基酸,為驗證是否是此41個氨基酸影響蛋白活性,以及獲得具有抗菌活性的重組蛋白,對成熟肽片段進行了研究。
　　 對成熟肽基因設計引物,構建重組質(zhì)粒pET-30a-a2c,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)誘導表達,鎳柱親和層析,SDS-PAGE顯示在14 kD有單一條帶,由于成熟肽A2C與載體His標簽融合,故表觀分子量比武分離純化的抗菌肽A2(9 kD)略大。經(jīng)檢

5、測,發(fā)現(xiàn)A2C也無抑菌活性。綜上分析可能是由于抗菌肽A2為糖蛋白(武報道),而大腸桿菌表達系統(tǒng)缺乏糖基化功能,所以表達的蛋白A2Q1、A2C沒有活性。
　　 酵母表達系統(tǒng)具有糖基化功能,故選取畢赤酵母表達系統(tǒng)進行以下研究。對全長基因設計引物(引入組氨酸標簽),構建重組質(zhì)粒pPIC9K-a2q2,線性化后,用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)甲醇低溫誘導,鎳柱親和層析,SDS-PAGE顯示在19 kD有單一條帶。經(jīng)檢測,發(fā)現(xiàn)表達