1、目的：棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的危害極其嚴重的土傳維管束真菌病害，每年給我國棉花生產(chǎn)造成極大的經(jīng)濟損失。該病用藥劑難于防治，成為棉花生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸。提高棉花對大麗輪枝菌的抗病性是亟待解決的問題。然而，大麗輪枝菌致病機理的研究仍停留在初步探索階段，病程關(guān)鍵基因的研究也較少。同時，大麗輪枝菌野生型菌株基因打靶效率低，阻礙了大麗輪枝菌病程關(guān)鍵基因的研究。因此，建立高效的大麗輪枝菌基因敲除體系分析病程關(guān)鍵基因的功能，并利用RNAi技術(shù)沉默寄

2、主體內(nèi)大麗輪枝菌病程關(guān)鍵基因可為防治棉花黃萎病提供技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。
　　方法：本研究利用 In-Fusion克隆技術(shù)構(gòu)建同源重組載體和農(nóng)桿菌介導的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化的方法建立高效的大麗輪枝菌基因敲除體系。并利用分子生物學、細胞生物學和質(zhì)譜-色譜等技術(shù)方法研究大麗輪枝菌質(zhì)膜蛋白（硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白）的功能，同時利用Gateway技術(shù)構(gòu)建RNAi載體，轉(zhuǎn)化本生煙。
　　結(jié)果和結(jié)論：1.利用同源重組和大量的轉(zhuǎn)化子篩選獲得大麗輪枝菌

3、ΔVdKu70缺陷突變體，對其進行功能分析，結(jié)果表明ΔVdKu70缺陷突變體菌株與野生型菌株相比，其形態(tài)特征（菌落直徑、生長率、孢子產(chǎn)量）和致病力基本一致。選擇三個潛在的毒素基因Vd2-OdE2、VdFreB、VdFre6作為敲除的靶基因分析ΔVdKu70缺陷突變體菌株的同源重組頻率。結(jié)果顯示ΔVdKu70缺陷突變體菌株的基因打靶效率相比野生型提高了22.8％-34.7%，顯著提高了基因打靶效率，實現(xiàn)了靶基因的精確打靶，為大麗輪枝菌致病

4、關(guān)鍵靶基因的研究提供了實驗背景菌株，建立了高效大麗輪枝菌基因敲除突變體的轉(zhuǎn)化體系。
　　2.利用同源重組和轉(zhuǎn)化子篩選獲得大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白基因敲除突變體菌株，命名為ΔVdThit。ΔVdThit突變體菌株的形態(tài)學特征（菌落直徑、生長率、孢子產(chǎn)量、孢子萌發(fā)率）分析結(jié)果表明：ΔVdThit突變體菌株的生長能力和生殖能力表現(xiàn)出顯著缺陷。ΔVdThit突變體菌株的逆境脅迫結(jié)果表明：ΔVdThit突變體菌株對逆境脅迫（紫外照射、活性氧

5、壓力、高滲透壓）的敏感性增強。
　　3.以本氏煙為寄主檢測ΔVdThit突變體的毒力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)寄主植株的感病程度顯著降低，并利用qPCR檢測寄主體內(nèi)的真菌生物量及寄主莖段的離體培養(yǎng)，結(jié)果顯示其毒力顯著降低。同時從細胞生物學方面利用熒光顯微鏡觀察VdΔThit-GFP菌株入侵和定殖過程，結(jié)果顯示在寄主入侵過程中出現(xiàn)顯著的缺陷。通過 HPLC-MS和GC-MS探索ΔVdThit突變體毒力降低的機制，結(jié)果顯示ΔVdThit突變體菌株中丙

6、酮酸代謝中間產(chǎn)物（乙酰輔酶A和乙偶姻）顯著降低，可能是毒力降低和逆境脅迫敏感性增強的重要原因之一。
　　4.通過補充外界不同濃度的硫胺素，ΔVdThit突變體菌株的形態(tài)特征（菌落直徑、產(chǎn)孢量）與毒力得到部分恢復。同時利用qPCR分析ΔVdThit突變體菌株中硫胺素從頭合成途徑基因的表達，結(jié)果顯示從頭合成途徑中兩個關(guān)鍵基因（VdSti35和Vdthi11）表達上調(diào)，且隨著外界硫胺素濃度的升高，兩個關(guān)鍵基因（VdSti35和Vdthi

7、11）表達量更高。表明硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白的主動運輸途徑是大麗輪枝菌硫胺素來源的主要途徑，從頭合成途徑僅是輔助途徑，暗示硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白是機體不可缺少的蛋白因子。
　　5.大麗輪枝菌不同生長時期和寄主入侵過程中硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達模式分析結(jié)果表明，硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白在大麗輪枝菌生長發(fā)育和入侵、定殖過程中起著不可替代的作用。同時本研究利用Gateway技術(shù)，構(gòu)建硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白基因的三段靶基因片段的RNAi載體，轉(zhuǎn)化本生煙，分別獲得多個株系的

8、轉(zhuǎn)大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白基因的靶標區(qū)段的本生煙植株，分別命名為 RNAi-VdThit-1、RNAi-VdThit-2、RNAi-VdThit-3。對獲得靶標區(qū)段的本生煙植株進行抗病性實驗，結(jié)果表明：獲得硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白靶標基因的本生煙植株對大麗輪枝菌的抗病性與野生型相比顯著增強，尤其是轉(zhuǎn)化獲得的靶標區(qū)段VdThit-1基因片段的本生煙植株的抗病性最強，對大麗輪枝菌的抗病性表現(xiàn)為高抗等級。
　　綜上研究結(jié)果表明：本研究獲得大麗輪枝