1、以三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)為研究材料,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的三角帆蚌cDNA文庫(kù)中已標(biāo)注的EST序列,利用RACE法克隆得到兩個(gè)三角帆蚌抗菌肽基因(theromacin、big defensin)的cDNA全序列,并對(duì)這2個(gè)基因的cDNA序列及推測(cè)得到的氨基酸序列特征進(jìn)行分析。利用實(shí)驗(yàn)室克隆得到的三角帆蚌β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)標(biāo),半定量PCR分別檢測(cè)2個(gè)基因在三角帆蚌外套膜、血液、肝、腎、胃、腸、鰓

2、、斧足8個(gè)組織的表達(dá)差異,并通過(guò)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophilia)感染,研究這2個(gè)基因在外套膜、血液、肝臟、腸、鰓和斧足6個(gè)組織在感染后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的表達(dá)情況究。通過(guò)構(gòu)建2個(gè)抗菌肽基因的原核表達(dá)載體并用IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)兩個(gè)基因的重組質(zhì)粒在表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)中表達(dá),SDS-PAGE進(jìn)行初步分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1)三角帆蚌theromacin基因的克隆和

3、分子結(jié)構(gòu)分析
　　該cDNA序列全長(zhǎng)為970bp,5‘端非翻譯區(qū)123bp,3‘端非翻譯區(qū)526bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為300bp,共編碼99個(gè)氨基酸,包含一段由27個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和72個(gè)氨基酸的成熟肽,分子量為10924.7u。氨基酸序列分析表明,該序列存在明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和疏水區(qū)。同源性分析表明,該基因編碼的蛋白與海兔(Aplysia californica)theromacin氨基酸序列的相似度最高為56％,而與貽

4、貝等中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽(defensins、mytilins、myticins和mytimycins)相似度較低。將所得的氨基酸序列與其他物種的不同抗菌肽的氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù),結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)克隆所得三角帆蚌 theromacin與已發(fā)表的幾種無(wú)脊椎動(dòng)物抗菌肽相聚,而不與兩種貽貝的抗菌肽聚集在一起,推測(cè)此基因與這兩種貽貝中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽不屬于同一種類型。
　　Jpred3軟件對(duì)三角帆蚌theromacin蛋白的二級(jí)結(jié)

5、構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,在第2-22、57-62氨基酸殘基處存在α螺旋,因此,三角帆蚌的theromacin蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。以水螅(Hydra magnipapillata)Hydramacin-1 A鏈三級(jí)結(jié)構(gòu)為模板,通過(guò)ESyPred3D預(yù)測(cè)三角帆蚌theromacin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示,此蛋白與水螅的Hydramacin-1三級(jí)結(jié)構(gòu)相似。
　　2)三角帆蚌big defensin基因的克隆和分子結(jié)構(gòu)分析
　　該cD

6、NA序列全長(zhǎng)為604bp,末端有典型的多聚腺苷酸信號(hào)序列AATAA和ploy(A)尾,5‘端非翻譯區(qū)166bp,3‘端非翻譯區(qū)96bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為342bp,共編碼113個(gè)氨基酸,包含一段由23個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和90個(gè)氨基酸的成熟肽,分子量為12554.6u。氨基酸序列分析表明,該序列存在明顯的跨膜結(jié)構(gòu)和疏水區(qū)。同源性分析顯示,該基因編碼的蛋白與文昌魚(Branchiostoma floridae)big defens

7、in氨基酸序列的相似度最高為64%,而與已知的防御素(α-、β-、θ-防御素和昆蟲(chóng)防御素)相似度較低。與已知big defensin氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn),在成熟肽部分均有相同的保守序C-X6-C-X3-C-X13(14)-C-X4-C-C。構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)所得的big defensin與已知的big defensins聚在一起。
　　Jpred3軟件對(duì)該基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,在第7-35、43-66氨基酸殘基

8、處存在α螺旋,在第41-42、95-97以及第104-108氨基酸殘基處存在β折疊。由此,該基因編碼的蛋白是包含跨膜螺旋的膜蛋白。以Takahide Kouno報(bào)道的日本馬蹄蟹(Japanese horseshoe crab)beta-defensin三級(jí)結(jié)構(gòu)(PDB id:2RNG)為模板,通過(guò)ESyPred3D預(yù)測(cè)獲得了HcBD蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu),二者結(jié)構(gòu)相似。
　　3)半定量和熒光定量分析
　　利用RT-PCR法以β-ac

9、tin基因作為內(nèi)參基因,檢測(cè)theromacin和big defensin兩個(gè)基因在健康三角帆蚌外套膜、血液、肝臟、胃、腸、鰓和斧足中的表達(dá)情況:
　　theromacin基因在8個(gè)組織中均有表達(dá),其中在三角帆蚌血液中的表達(dá)量最高,在外套膜、肝臟和鰓中微量表達(dá),在腎、胃、腸和斧足中表達(dá)量較少。
　　big defensin基因在8個(gè)組織中并非完全表達(dá),僅在外套膜、血液、肝、腎、胃和腸中有表達(dá),其中,在健康三角帆蚌外套膜、血液

10、中的表達(dá)量相對(duì)其他組織較高,在肝、腎、胃和腸中的表達(dá)量較低,在鰓和斧足中沒(méi)有檢測(cè)到有big defensin基因的表達(dá)。
　　在受嗜水氣單胞菌感染后2h、4h、6h、12h、24h、48h和72h等7個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)theromacin、big defensin在外套膜、血液、肝臟、腸、鰓和斧足中的表達(dá)情況。
　　在外套膜中,theromacin、big defensin分別在4h、6h表達(dá)量最高,而二者均在12h表達(dá)量最低;在

11、血液中,theromacin、big defensin均在72h表達(dá)量最高,分別在6h、48h表達(dá)量最低;在肝臟中,theromacin在4h表達(dá)量最高,而big defensin在48h達(dá)到峰值,二者均在24h表達(dá)量最低;在腸中,theromacin、big defensin的峰值和最低值分別是4h和24h、72h和6h;在鰓中,二者的峰值和最低值分別是4h和24h,2h和6h;在斧足中,二者均在4h達(dá)到峰值,分別在24h、12h表達(dá)