1、抗菌肽(antibacterial peptide)又稱為抗微生物肽或肽抗生素，是自然界中普遍存在的一類陽離子活性多肽，在細胞菌、植物、昆蟲、魚類、兩棲類和哺乳類中均有分布，具有廣譜殺菌作用，且不會產(chǎn)生耐受性，作為抵御病原體入侵的第一道防線，是機體非特異性免疫的重要組成部分。魚類抗菌肽在國際近幾年才開始進行研究，以色列學者Oren等首先從豹鰨(Paradachirus marmoratus)體上分離到一種33個氨基酸殘基的抗菌肽并命名為

2、pardaxin。此肽具有螺旋——卷曲——螺旋的結(jié)構(gòu)模式，具有比蜂毒素更強的抗菌活性和更低的人紅血球溶血活性，其作用可與其它天然的抗菌肽如蛙皮素、殺菌肽等相比。電鏡觀察顯示其抑菌的機制是溶解細菌的細胞壁。其后不同研究者分別從美洲擬鰈、七鰓鰻、泥鰍等多種魚類中分離得到了不同魚類抗菌肽。由于魚類是適應性免疫防御剛剛開始出現(xiàn)的動物，其適應性免疫防御機制尚不完善，魚類所生活的水環(huán)境中存在大量細菌病原體，因而其天然免疫防御機制顯得尤為重要。對魚類

3、抗菌肽的研究不僅有助于了解魚類的天然免疫機制，同時有助于我們在生產(chǎn)實踐中尋找新的抗菌藥物，提高魚類的抗病性提供新的思路。
　　本實驗以新鮮的鯉為實驗材料，用100％丙酮和90％甲醇配制的提取液，從新鮮鯉的鰓、皮膚、肝、腎組織中提取抗菌肽，并對鯉抗菌肽粗提物進行了部分性質(zhì)檢測。抑菌實驗證明，鯉各組織提取物對大腸桿菌、鰻弧菌有較強的抑制作用，而對金黃色葡萄球菌的抑制效果不明顯，并且不同組織的抑制作用有所差別。提取物經(jīng)過加熱處理后，抑菌

4、圈略有變小。相反，經(jīng)過胰蛋白酶處理后，抑菌圈略有變大。以上結(jié)果表明，鯉的多種組織中含有對細菌有抑制作用的抗菌肽。
　　根據(jù)多種動物hepcidin cDNA序列比對結(jié)果，根據(jù)其保守區(qū)序列設(shè)計引物，利用RT-PCR方法克隆得到鯉hepcidin的cDNA片段，然后采用5`-RACE和3`-RACE技術(shù)得到其全長cDNA序列；采用以基因組DNA為模板，利用RT—PCR方法擴增得到了鯉魚hepcidin的基因組DNA序列，對其內(nèi)含子-外

5、顯子結(jié)構(gòu)進行了分析。結(jié)果表明，鯉魚hepcidin cDNA全長647 bp，由46 bp的5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)，276 bp的開放閱讀框(ORF)和325 bp的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)組成，其中ORF區(qū)編碼91個氨基酸的前體hepcidin，由24個氨基酸殘基的信號肽、42個氨基酸殘基的前域和25個氨基酸殘基的成熟肽組成。鯉魚 hepcidin成熟肽由25個氨基酸組成，含有8個保守的半胱氨酸殘基，通過4個鏈內(nèi)二硫鍵形成短

6、的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，拐角處有一特殊的二硫鍵，可能與多肽的抗菌活性直接相關(guān)。鯉魚hepcidin基因組DNA全長1209 bp，由三個外顯子和兩個內(nèi)含子組成，外顯子1編碼部分5'-UTR、信號肽和部分前域，外顯子2編碼部分前域，外顯子3編碼部分前域、成熟肽和3'-UTR。
　　采用RT-PCR方法檢測了該基因 mRNA在正常鯉魚肝臟、脾臟、頭腎、前腸、后腸、口腔上皮、鰓、皮膚、肌肉、性腺和血液等組織的分布，采用Real-time PCR技術(shù)

7、檢測了鰻弧菌浸泡刺激后鯉魚肝臟、頭腎、前腸和后腸中mRNA水平的變化。RT-PCR檢測表明，在正常鯉魚中，肝臟中hepcidin mRNA水平最高，其次為脾臟、后腸、頭腎、前腸、口腔上皮、皮膚、性腺和血細胞，在鰓中的水平較低，而在肌肉中則未檢測到其mRNA。Real-time PCR檢測表明，鯉魚經(jīng)過鰻弧菌浸泡刺激后，各組織hepcidin mRNA水平整體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，但不同組織的變化模式并不相同。肝臟、頭腎和后腸hepci

8、din mRNA水平在刺激后6 h就達到最大值，肝臟中約為正常水平的3倍，頭腎和后腸可達到正常水平的17倍；前腸hepcidin mRNA水平在刺激后6 h開始升高，到72 h才達到最大值，約為正常水平的8倍。
　　利用能夠在畢氏酵母中特異表達的載體pPIC9K，構(gòu)建了可以在E。coli和畢氏酵母中表達的穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli后提取質(zhì)粒并線性化，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母，在BMG培養(yǎng)基上篩選行到轉(zhuǎn)鯉hepcidin基因的畢氏酵母菌，PC