1、由創(chuàng)傷或骨病引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損臨床十分常見，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)頑固性疼痛、關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，嚴(yán)重影響患者日?；顒?dòng)和生活質(zhì)量［1,2］，是目前肢體殘障的主要原因之一。關(guān)節(jié)軟骨缺少血管、神經(jīng)及淋巴系統(tǒng)，當(dāng)其缺損直徑>3mm時(shí)無法自身修復(fù)，目前臨床主要治療方法均存在或多或少的缺陷。近年來快速發(fā)展的組織工程技術(shù)，為關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生修復(fù)治療提供了新思路和新方法。
　　 關(guān)節(jié)軟骨組織工程技術(shù)主要由支架材料制備、種子細(xì)胞獲取及體外組織構(gòu)建三部分組

2、成。理想的關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架材料應(yīng)具備：①良好的生物相容性，支架本身和支架降解所產(chǎn)生的物質(zhì)不引起毒性反應(yīng)；②適度的生物降解性，降解速度和軟骨再生的速度相匹配；③具有足夠的力學(xué)強(qiáng)度；④具有一定的孔隙和孔徑，且孔隙率達(dá)到90％以上、孔徑為100-300μm，以利于細(xì)胞的黏附和生長；⑤良好的生物活性。目前應(yīng)用的支架材料主要包括：①天然材料，如膠原蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等；②
　　 人工合成材料，如聚乳酸、聚乙烯醇等。應(yīng)用這些支架

3、材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果，距離臨床要求仍有一定差距，其主要原因包括：①應(yīng)用的材料生物活性不足，②支架材料的組織相容性不好，③新生組織不能與原組織很好的接合，④支架降解速度與組織再生速度不相當(dāng)?shù)取?br>　　 本研究依據(jù)材料學(xué)仿生和復(fù)合原理，在完成豬Ⅱ型膠原蛋白海綿支架的制備及其相關(guān)性能檢測基礎(chǔ)上，應(yīng)用天然關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分：Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ，ColⅡ）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，C

4、S）、透明質(zhì)酸（hyaluronanHA），并復(fù)合具有良好力學(xué)強(qiáng)度、生物相容性與可降解性的人工合成聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）制備關(guān)節(jié)軟骨組織工程ColⅡ-CS-HA-PVA 仿生支架。通過對所構(gòu)建的ColⅡ-CS-HA-PVA 復(fù)合支架相關(guān)的理化檢測、細(xì)胞與支架復(fù)合后體外共培養(yǎng)、兔背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)，證實(shí)所構(gòu)建的ColⅡ-CS-HA-PVA 復(fù)合支架在力學(xué)方面有明顯的提高，并且對細(xì)胞無毒副作用，具有良好的組織相

5、容性。
　　 第一部分豬Ⅱ型膠原蛋白海綿支架的制備本部分研究為了更好的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，依據(jù)材料仿生原理，提取正常成年豬膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中主要成分Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ），應(yīng)用所提取的ColⅡ?yàn)椴牧蠎?yīng)用真空凍干技術(shù)來制備海綿支架，并對所制備的海綿支架理化性能進(jìn)行相關(guān)檢測。
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1．參照本實(shí)驗(yàn)室建立的ColⅡ的提取方法，從豬膝關(guān)節(jié)透明軟骨中提取ColⅡ，應(yīng)用真空凍干方法來制備膠原蛋白海綿支

6、架；
　　 2．海綿支架理化性能相關(guān)檢測（1）組織切片染色和掃描電鏡觀察觀察海綿支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
　　 （2）支架生物力學(xué)測試；
　　 （3）體外降解實(shí)驗(yàn)評價(jià)所構(gòu)建的海綿支架降解速度；
　　 （4）支架-細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測海綿支架細(xì)胞相容性；
　　 3．?dāng)?shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0.軟件進(jìn)行分析。
　　 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1．構(gòu)建的膠原海綿支架具備良好的孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙率可以達(dá)到約90％

7、，組織學(xué)染色觀察支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，各孔之間彼此聯(lián)通，且有良好的孔通率；
　　 2．對支架進(jìn)行生物力學(xué)測試發(fā)現(xiàn)所能承受的最大拉力為0.33N；
　　 3．通過降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提高膠原蛋白濃度所構(gòu)建的支架降解速度有所減慢，經(jīng)EDC 改性后，降解速度較改性前也有明顯減慢（p<0.05）；
　　 4．發(fā)現(xiàn)種子細(xì)胞在所構(gòu)建的海綿支架上黏附良好，并且在支架的孔壁上生長旺盛，細(xì)胞形態(tài)良好；
　　 三、結(jié)論
　

8、　 通過本實(shí)驗(yàn)方法可以構(gòu)建出膠原海綿支架，對支架掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的海綿支架具有良好的孔徑和孔隙率；組織化學(xué)染色觀察，發(fā)現(xiàn)海綿支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，各孔之間彼此相通，細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)和兔背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)證實(shí)所構(gòu)建的海綿支架具有良好的組織相容性，可以為種子細(xì)胞提供一個(gè)良好的、安全的生長場所。但通相關(guān)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此支架存有如下問題：1.與天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要成分相比材料還不夠仿生；2.力學(xué)強(qiáng)度還不夠滿意。因此，在第二部分實(shí)驗(yàn)中在材料和

9、強(qiáng)度方面加以改進(jìn)。
　　 第二部分 ColⅡ-CS-HA-PVA 軟骨仿生支架的構(gòu)建針對上一部分實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建支架存在的不足，本部分在Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）中添加硫酸軟骨素（CS）和透明質(zhì)酸（HA）來構(gòu)建仿生支架，通過添加高分子聚合物聚乙烯醇（PVA）的方法來提高膠原蛋白支架的力學(xué)性能，并對改進(jìn)后所構(gòu)建的復(fù)合支架相關(guān)理化性能進(jìn)行檢測分析。
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1．應(yīng)用提取的Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）、硫酸軟骨素

10、（CS）、透明質(zhì)酸（HA）
　　 和高分子聚合物聚乙烯醇（PVA）使用冷凍干燥等技術(shù)來構(gòu)建組織工程復(fù)合支架；
　　 2．復(fù)合支架理化性能相關(guān)檢測（1）組織化學(xué)染色和掃描電鏡觀察支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
　　 （2）力學(xué)測試檢驗(yàn)支架的力學(xué)強(qiáng)度；
　　 （3）支架-細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測海綿支架細(xì)胞相容性；
　　 （4）兔背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)，檢測支架組織相容性；
　　 3．?dāng)?shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

11、分析。
　　 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1．掃面電鏡觀察，ColⅡ-HA-CS-PVA 復(fù)合支架孔隙均勻，孔隙率可以達(dá)到約93％，組織學(xué)染色觀察支架呈現(xiàn)出良好的，且彼此聯(lián)通的孔隙結(jié)構(gòu)，且有良好的孔通率；
　　 2．經(jīng)力學(xué)測試，ColⅡ-HA-CS-PVA 復(fù)合支架最大張力約為1.19N，單純ColⅡ
　　 -HA-CS 復(fù)合支架約為0.55N，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.985，P=0.002）；
　　

12、3．支架-細(xì)胞共培養(yǎng)，組織學(xué)HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在支架的孔壁上粘附并且生長旺盛，細(xì)胞形態(tài)良好；
　　 4．兔背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)，組織切片染色觀察證實(shí)，植入支架材料具有良好的組織相容性。
　　 三、結(jié)論
　　 對所構(gòu)建ColⅡ-HA-CS-PVA 復(fù)合支架通過掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)；組織化學(xué)染色觀察，可以看到海綿支架孔隙結(jié)構(gòu)良好，彼此相通；在支架上接種細(xì)胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)具備良好的細(xì)胞相容性，可為種

13、子細(xì)胞增殖和分化提供一個(gè)適宜的三維環(huán)境；兔背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)證實(shí)所構(gòu)建的海綿支架具有良好的組織相容性。
　　 全文結(jié)論
　　 本研究所構(gòu)建的ColⅡ-HA-CS-PVA 復(fù)合支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，在材料上也更加仿生，添加PVA后有效彌補(bǔ)了單純應(yīng)用ColⅡ?yàn)椴牧纤鶚?gòu)建的支架強(qiáng)度不夠的問題，通過支架-細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，支架具有良好的細(xì)胞相容性；兔背部皮下埋植實(shí)驗(yàn)證實(shí)支架具有良好的組織相容性，下一步準(zhǔn)備進(jìn)行大樣本量動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺