1、目的：探討雙層殼聚糖(CS)/羥基磷灰石(HA)復合支架作為骨軟骨組織工程支架的可行性。 方法：1 CS/HA支架分二步制成。燒結(jié)法制作羥基磷灰石(HA)支架(成品購于四川大學)，取3％的殼聚糖溶液倒在置入模具中的HA支架上，-20℃冰箱預凍10h，凍干機中冷凍抽干24h制作雙層殼聚糖(CS)/羥基磷灰石(HA)復合支架，傅立葉紅外光譜、掃描電鏡、液體置換法測定其理化性質(zhì)。無菌胸骨穿刺針從脛骨上段采取日本大耳白兔的骨髓約4ml，

2、全骨髓培養(yǎng)法分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells BMSCs)，10％胎牛血清的L-DMEM作為細胞培養(yǎng)基，在37℃、體積分數(shù)為5％的CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周換液兩次。取P2代骨髓問充質(zhì)干細胞，免疫細胞化學測定其細胞表面抗原CD44、CD45，以用作對骨髓間充質(zhì)干細胞的初步鑒定。P2代自體骨髓間充質(zhì)干細胞為種子細胞，運用纖維蛋白膠種植技術，以雙層殼聚糖(CS)/羥基磷灰石(HA)復合支

3、架為載體，制作成細胞-支架復合體，掃描電鏡檢測細胞在支架內(nèi)的分布。36只3月齡日本大耳白兔36膝，取右膝股骨滑車負重區(qū)制作成骨軟骨缺損模型，直徑大小約4 mm，深3mm。實驗分為三組，修復骨軟骨缺損模型，每組12只膝，實驗(A)組：BMSc+支架，對照(B)組：單純支架，對照(C)組：未治療，分別于6w，12w取材，進行大體觀察、組織學檢測，改良Wakitani法評分軟骨修復效果，比較各組修復效果差異。結(jié)果：1 CS/HA支架的理化性質(zhì)

4、：CS層孔隙率為76±5.01％，孔徑為200-400 μm，平均為300 μm左右，孔相通性好，HA層孔隙率為72±4.23％，孔徑直徑為200-500 μm，平均為350 μm左右，孔相通性好，傅立葉紅外光譜儀測定的數(shù)據(jù)表明復合支架組成物有典型的CS和HA峰，沒有發(fā)現(xiàn)有聚乙二醇峰。2全骨髓法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，第10-14天可見集落形成，14天傳代，細胞貼壁生長，呈成纖維樣。免疫細胞化學檢測細胞表面抗原CD44(+)，CD45(-

5、)，與文獻報道一致。 3掃描電鏡觀察BMSCs接種在CS/HA支架上10h后，附著在殼聚糖支架上，生長較好，并未完全伸展開來，附著在HA支架的MSCs部分伸展開來，并伸出細胞突起。實驗動物術后1周恢復正常活動，觀察期間動物無膝關節(jié)腫脹、感染、死亡。術后12w大體觀察顯示，A、B組基本修復軟骨缺損，修復區(qū)表面平整光滑，與周圍正常軟骨不易區(qū)分，但A組的再生組織是不透明的，與周圍宿主骨結(jié)合好。B組的再生組織是白色的，與周圍宿主骨界限清

6、楚。C組的再生組織是不規(guī)則的和凹凸不平的。組織學觀察：A組表面有成熟的軟骨組織，細胞數(shù)量多、體積相對較大，出現(xiàn)柱樣排列的細胞群，見典型的軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)和同源細胞群，軟骨周圍為染色均一的玻璃樣基質(zhì)，修復組織甲苯胺藍異染性強，可以認為是透明軟骨修復為主。軟骨下骨區(qū)可見HA仍未完全吸收，未見CS樣物，炎癥細胞較6W時少，有少量骨小梁長入，B組可見軟骨細胞較6W時增多，仍由纖維樣組織修復軟骨缺損，軟骨下骨區(qū)可見少量的未降解的HA內(nèi)有大量的炎性細