1、目的:①Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，為組織工程骨的構(gòu)建提供種子細(xì)胞。
　?、趯?duì)比評(píng)價(jià)納米羥基磷灰石-殼聚糖(nano-hydroxyapatite-chitosan，nHA-CS)和殼聚糖(chitosan，CS)支架與大鼠BMSCs的生物相容性。
　?、墼u(píng)價(jià)大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)后的成骨分化性

2、能。
　?、軐?duì)比評(píng)價(jià)納米羥基磷灰石-殼聚糖和殼聚糖支架材料的異位成骨能力。
　　方法:①無菌分離8周齡健康SD大鼠股骨，沖洗骨髓腔獲取骨髓，采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得形態(tài)較為單一的貼壁細(xì)胞。
　　②將實(shí)驗(yàn)分為nHA-CS組、CS組以及對(duì)照組，采用計(jì)數(shù)法測(cè)定接種2h、4h、6h、8h、12h后的細(xì)胞粘附率，細(xì)胞粘附率=（接種細(xì)胞數(shù)-未粘附細(xì)胞數(shù)）/接種細(xì)胞數(shù);采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;倒置顯

3、微鏡觀察細(xì)胞在支架周圍的生長(zhǎng)情況;激光共聚焦顯微鏡掃描觀察細(xì)胞在支架上的粘附生長(zhǎng)狀況。
　?、墼赑3代BMSCs成骨誘導(dǎo)后3d，對(duì)其行鈣-鈷染色，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá);成骨誘導(dǎo)后21天對(duì)其行Von Kossa染色和茜素紅染色，檢測(cè)細(xì)胞外鈣鹽沉積。
　　④采用2月齡SPS級(jí)健康SD雄性大鼠65只，體重186.4g～217.5g，平均(202.9±7.2)g，將其隨機(jī)分為五組:Ⅰ組為細(xì)胞復(fù)合nHA-CS支架組，Ⅱ組為細(xì)胞復(fù)合

4、CS支架組，Ⅲ組為單純nHA-CS支架組，Ⅳ組為單純CS支架組，Ⅴ組為空白對(duì)照組。將內(nèi)植物植入大鼠肌袋內(nèi)，分別于術(shù)后2、4、6、8、12周對(duì)大鼠股骨行CT掃描，組織標(biāo)本切片HE染色和Masson染色以評(píng)估支架異位成骨情況。
　　結(jié)果:①采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得大量形態(tài)較為均一，呈梭形和成纖維形，方向性排列的貼壁細(xì)胞。
　　②nHA-CS組、CS組以及無支架對(duì)照組，接種2h、4h、6h、8h、12h后的細(xì)

5、胞平均粘附率分別為:(80.23±4.73)％、(84.48±5.17)％、(86.77±3.10)％、(86.77±3.10)％、(88.02±2.07)％；(78.49±5.25)％、(83.12±5.45)％、(83.12±5.45)％、(87.04±3.95)％、(87.04±3.95)％；(84.42±4.27)％、(87.04±3.20)％、(89.38±3.02)％、(90.69±2.48)％、(90.69±2.48)％。

6、統(tǒng)計(jì)分析顯示在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞粘附率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞接種后1-4天nHA-CS組、CS組以及對(duì)照組細(xì)胞按照正常速度增殖，第5天細(xì)胞增殖速度有所下降，至6-9天三組細(xì)胞增殖速度均明顯減緩，出現(xiàn)細(xì)胞增殖平臺(tái)。三組曲線整體趨勢(shì)相同，呈現(xiàn)“S”形。細(xì)胞支架復(fù)合培養(yǎng)24h后，nHA-CS支架和CS支架周圍均可見細(xì)胞圍繞支架邊緣貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，鏡下透亮度高，細(xì)胞狀態(tài)良好。激光共聚焦顯微鏡掃描見細(xì)胞接種48h后大量細(xì)胞粘附于nHA-CS支架

7、和CS支架孔壁之上。
　?、鄢晒钦T導(dǎo)3d后，鈣-鈷法染色見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量黑色顆粒狀沉積，顯示細(xì)胞內(nèi)ALP表達(dá);誘導(dǎo)21d后，Von Kossa法染色和茜素紅染色，分別見細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)褐色和紅色鈣結(jié)節(jié)。
　　④術(shù)后CT示各組植入物均位于大腿肌肉組織內(nèi)靠近股骨。在術(shù)后第2周nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組和CS復(fù)合細(xì)胞組即可見新生骨組織形成，而單純CS組則在6周以后才見新生骨形成。各組植入部位新骨形成隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增

8、加，并且在同一時(shí)間點(diǎn)nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組的新骨形成要明顯多于單純nHA-CS組，CS復(fù)合細(xì)胞組明顯多于單純CS組。HE染色示2周時(shí)各組支架孔隙內(nèi)骨樣組織沉積，隨時(shí)間延長(zhǎng)，骨樣組織逐漸增多，軟骨樣組織形成，骨化逐漸發(fā)生。對(duì)各組不同時(shí)間點(diǎn)的骨面積分?jǐn)?shù)和支架剩余面積分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn):各組的骨面積分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)分別逐漸增加(P＜0.05)，在相同時(shí)間點(diǎn)，各組的骨面積分?jǐn)?shù)均有差異，nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組最高，其次分別為CS復(fù)合細(xì)胞組、

9、單純nHA-CS組、單純CS組(P＜0.05);而隨時(shí)間延長(zhǎng)各組的支架剩余分?jǐn)?shù)分別逐漸降低(P＜0.05)，在相同時(shí)間點(diǎn)，單純CS組的支架剩余面積分?jǐn)?shù)最高，其次分別為單純nHA-CS組、CS復(fù)合細(xì)胞組、nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組(P＜0.05)。Masson染色顯示膠原蛋白首先在骨樣沉積組織之間產(chǎn)生，后逐漸增多交織呈網(wǎng)狀、板層狀，構(gòu)成成骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)。統(tǒng)計(jì)分析膠原面積分?jǐn)?shù)發(fā)現(xiàn):隨時(shí)間增加，各組膠原面積分?jǐn)?shù)逐漸增加(P＜0.05);在相同

10、時(shí)間點(diǎn)，不同組之間的膠原面積分?jǐn)?shù)以nHA-CS復(fù)合細(xì)胞組最高，其次分別為CS復(fù)合細(xì)胞組、單純nHA-CS組、單純CS組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:①Percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法是一種理想的分離BMSCs的方法。
　?、趎HA-CS支架和CS支架與BMSCs之間均均有良好的體外生物相容性，二者在對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響、細(xì)胞粘附效率等方面均無明顯差異。
　?、鄄捎煤?0-8mol/L地塞米松、10mmol/Lβ