1、目的：
　　胰腺癌惡性程度高，發(fā)病率逐年上升，死亡率居高不下，尚無(wú)特別有效的治療方法。盡管近年來(lái)在醫(yī)學(xué)影像學(xué)、新放化療技術(shù)、免疫治療等方面均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，胰腺癌5年生存率依然低于5％。不斷有研究指出，在胰腺導(dǎo)管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC)組織中microRNA(miRNA)的表達(dá)譜發(fā)生顯著改變，調(diào)控相應(yīng)靶基因的表達(dá)，在腫瘤的起始、進(jìn)展等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，具有癌基因或抑癌

2、基因樣作用，可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為。目前，有研究通過(guò)質(zhì)?；虿《緮y帶miRNA從而改變其在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，起到治療腫瘤的作用。例如，有研究指出miR-34a和miR-let7在胰腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，具有抑癌基因樣作用。利用納米粒子和CC9肽能夠成功將具有抑癌作用的miR-34a轉(zhuǎn)入PDAC細(xì)胞，從而抑制胰腺癌動(dòng)物皮下移植瘤的生長(zhǎng)。Torrisani等人則通過(guò)質(zhì)?；蚵《緮y帶miRNA從而

3、提高miR-let7的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制PDAC細(xì)胞增殖的目的。盡管如此，針對(duì)單一miRNA的干預(yù)治療對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的抑制效果仍然有限，因此我們?cè)O(shè)想在增殖性溶瘤腺病毒的基礎(chǔ)上同時(shí)克隆入具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7，獲得同時(shí)攜帶miR-34a和miR-let7的重組腺病毒治療體系A(chǔ)dCEAp-miR34a-let7，在CEA啟動(dòng)子調(diào)控下介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高效表達(dá)和釋放具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7，發(fā)揮二者

4、的協(xié)同抗腫瘤作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的靶向干預(yù)治療。
　　方法：
　　1、腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定:以攜帶CEA啟動(dòng)子的Ad5F35嵌合型腺病毒為載體，分別克隆入具有抑癌作用的miR-34a和miR-let7基因序列，構(gòu)建AdCEAp-miR34a-let7治療體系，以及陽(yáng)性對(duì)照組AdCEAp-miR34a和AdCEAp-miRlet7，同時(shí)構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EGFP)的對(duì)照腺病毒AdCEAp-EGFP和Ad5-EGFP

5、，并進(jìn)行病毒基因組的鑒定。
　　2、溶瘤腺病毒特異性增殖活性的鑒定:用AdCEAp-EGFP和Ad5-EGFP感染人胰腺癌細(xì)胞系Panc-1、Capa-2、SW1990、BxPC3及人正常成纖維細(xì)胞BJ、MRC-5細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞比例及強(qiáng)度。另用AdCEAp-miR34a-let7、AdCEAp-miR34a、AdCEAp-miRlet7及Ad5-miR34a-let7感染上述細(xì)胞，經(jīng)TCID50方法檢測(cè)

6、病毒滴度，Western Blotting方法檢測(cè)腺病毒Ela基因表達(dá)。
　　3、腺病毒介導(dǎo)miRNAs的表達(dá):以MOI=1pfu/cell的強(qiáng)度感染腺病毒AdCEAp-miR34a-let7及Ad5-miR34a-let7。抽提總miRNA后經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)miR-34a和miR-let7的表達(dá)。
　　4、腺病毒介導(dǎo)雙miRNAs表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響:以胰腺癌細(xì)胞系和正常成纖維

7、細(xì)胞為研究對(duì)象，以MOI=1pfu/cell強(qiáng)度感染AdCEAp-miR34a-let7、AdCEAp-miR34a、AdCEAp-miRlet7及Ad5-miR34a-let7，另設(shè)不加病毒的親代細(xì)胞同步培養(yǎng)作為空白對(duì)照。通過(guò)四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)（MTT法）檢測(cè)腺病毒介導(dǎo)雙miRNAs表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞增殖活性的影響;通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該治療體系對(duì)胰腺癌細(xì)胞系凋

8、亡能力的影響;提取細(xì)胞總蛋白后，采用Western Blotting方法檢測(cè)miR-34a和miR-let7相應(yīng)靶蛋白以及信號(hào)分子的表達(dá)。
　　5、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn):構(gòu)建裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型，瘤內(nèi)注射上述治療體系，觀察并記錄移植瘤生長(zhǎng)情況，并繪制生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)其對(duì)胰腺癌生長(zhǎng)的抑制能力。
　　結(jié)果：
　　1.腺病毒特異性增殖活性的鑒定:攜帶EGFP報(bào)告基因的增殖腺病毒AdCEAp-EGFP在胰腺癌Panc-1、Capa-

9、2、SW1990、BxPC3細(xì)胞中增殖明顯，而在正常成纖維細(xì)胞BJ、MRC-5細(xì)胞中無(wú)增殖。非增殖腺病毒Ad5-EGFP在所有細(xì)胞系中均不增殖。TCID50檢測(cè)結(jié)果顯示AdCEAp-miR34a-let7、AdCEAp-miR34a、AdCEAp-miRlet7在4株胰腺癌細(xì)胞系中增殖明顯，而在正常細(xì)胞系BJ和MRC-5中不增殖。Ad5-miR34a-let7在所有細(xì)胞系中均增殖不明顯。Ela基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AdCEAp-miR34a-l

10、et7在Panc-1、Capa-2、SW1990、BxPC3細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)Ela，而在BJ、MRC-5細(xì)胞中不表達(dá)。
　　2.腫瘤特異性增殖腺病毒介導(dǎo)miRNAs的表達(dá):qRT-PCR檢測(cè)證實(shí)腺病毒AdCEAp-miR34a-let7介導(dǎo)miR-34a和miR-let7在胰腺癌細(xì)胞系中高水平表達(dá)，而在正常成纖維細(xì)胞系中則表達(dá)量極少。Ad5-miR34a-let7在所有細(xì)胞系中表達(dá)miR-34a和let-7均處于低水平。
　　

11、3.腫瘤特異性增殖腺病毒介導(dǎo)的雙miRNAs表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖活性有抑制作用:MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，在胰腺癌Pane-1細(xì)胞及SW1990細(xì)胞中，AdCEAp-miR34a-let7組與陰性對(duì)照組相比，腫瘤細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Panc-1細(xì)胞P＜0.001，SW1990細(xì)胞P＜0.01);AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miRlet7組相比，細(xì)胞增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Panc-1細(xì)

12、胞P＜0.01，SW1990細(xì)胞P＜0.05）;AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miR34a組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（兩種細(xì)胞均為P＞0.05）。
　　4.腫瘤特異性增殖腺病毒介導(dǎo)的雙miRNAs表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力有抑制作用:Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AdCEAp-miR34a-let7組相比AdCEAp-miR34a組、AdCEAp-miRlet7組、Ad5-miR34a-let7組及空白

13、對(duì)照組相比，前者胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力及遷移能力均受到抑制。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miRlet7組及陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著被抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　5.腫瘤特異性增殖腺病毒介導(dǎo)的雙miRNAs表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡:流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，胰腺癌Panc-1細(xì)胞在感染攜帶miRNA的增殖性腺病毒后，其凋亡率均上升，其中AdCEAp-miR34

14、a-let7組與AdCEAp-miRlet7組及Ad5-miR34a-let7組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);AdCEAp-miR34a-let7組與AdCEAp-miR34a組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.054)。
　　6.腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒介導(dǎo)的雙miRNAs表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響:Western Blotting方法檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)AdCEAp-miR34a-let7治療組相比空白對(duì)照組，miR-3

15、4a的靶蛋白cyclins-D1、E2F1及Bcl-2表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CDK4未發(fā)現(xiàn)顯著下降;miR-let7的靶蛋白HMGA2及CRD-BP表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而k-ras表達(dá)水平無(wú)顯著降低。
　　7.腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒介導(dǎo)的雙miRNAs表達(dá)對(duì)胰腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)有抑制作用:成功構(gòu)建了裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型。其中，表達(dá)雙miRNA的AdCEAp-miR34a-let7治療組腫瘤生長(zhǎng)速度明

16、顯低于其余各組，治療21天后，AdCEAp-miR34a-let7治療組腫瘤體積并無(wú)明顯上升，且有降低趨勢(shì);其次是AdCEAp-miR34a和AdCEAp-miRlet7組，非增殖腺病毒雖然表達(dá)雙miRNAs，但其抗腫瘤效果不理想。
　　結(jié)論：
　　在本課題的研究中，我們利用CEA啟動(dòng)子調(diào)控的腫瘤特異性增殖腺病毒載體的腫瘤特異性，攜帶兩種具有抑癌作用的miRNA，構(gòu)建一種治療體系，使其特異性作用于腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮兩種miRNA

17、的協(xié)同抗腫瘤作用。為胰腺癌的治療提供了一種新的思路，主要結(jié)論有:
　　1.成功構(gòu)建了一種對(duì)胰腺癌細(xì)胞有抑制作用的以增殖性溶瘤腺病毒為載體的攜帶雙miRNAs的治療系統(tǒng)AdCEAp-miR34a-let7，該系統(tǒng)在胰腺癌細(xì)胞中特異性增殖，而在正常成纖維細(xì)胞中增殖不明顯;在胰腺癌細(xì)胞中具有表達(dá)腺病毒Ela基因的能力，能在胰腺癌細(xì)胞系中高水平表達(dá)miR-34a及miR-let7，而在正常成纖維細(xì)胞中不表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明該治療系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞