1、胰腺癌是一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與多種基因異常有關(guān)。胰腺癌手術(shù)切除率低，傳統(tǒng)的治療效果差，有待于探討新的治療方法。近年來發(fā)現(xiàn)，凋亡抑制在胰腺癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，因此，通過增加細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是胰腺癌治療的有效措施之一。 PUMA是2001年發(fā)現(xiàn)的具有較強(qiáng)的促凋亡作用的P53下游基因，是公認(rèn)的抑癌基因。PUMA在許多惡性腫瘤中表達(dá)缺失或低表達(dá)，PUMA低表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)P

2、UMA表達(dá)具有明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。本課題旨在探討PUMA在胰腺癌中的表達(dá)及意義及PUMA基因在胰腺癌中的作用。 第一部分、PUMA在胰腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義 目的：研究胰腺癌組織中PUMA蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，初步探討PUMA在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。 方法：應(yīng)用免疫組化Envision方法檢測(cè)60例胰腺導(dǎo)管癌組織石蠟標(biāo)本中PUMA，Bcl—2和蛋白表達(dá)以及19例正常胰腺組織石蠟標(biāo)本中PUMA蛋白

3、表達(dá)，RT—PCR、Western blotting檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)免疫組化的檢測(cè)結(jié)果。TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分析PUMA表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系以及PUMA與AI、P53、Bcl—2表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果：PUMA在胰腺癌組織中的陽性率為30%（18/60），低于正常胰腺組織90%（17/19），差異有顯著性（P=0．002）； RT—PCR、Western blotting檢測(cè)證實(shí)了免疫組化結(jié)果；PUMA表達(dá)與腫瘤大小（P<

4、0．05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0．05）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0．05），而與腫瘤分化程度和TNM分期無關(guān)（分別P>0．05）；在PUMA陽性和陰性表達(dá)的腫瘤組織中，細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）分別17．63%±6．27%和13．44%±5．86%，差異有顯著性（p<0．05）；在PUMA陰性表達(dá)的腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于正常胰腺組織（16．12%±5．72%），差異有顯著性（p<0．05）； P53和Bcl—2在胰腺癌中的表達(dá)率分別為46

5、．7%（28/60）和41．7%（25/60），PUMA與P53和Bcl—2表達(dá)分別有顯著的負(fù)相關(guān)性（p=0．013和P=0．046）。 結(jié)論：胰腺癌細(xì)胞凋亡抑制及腫瘤轉(zhuǎn)移與PUMA蛋白表達(dá)缺失有關(guān)，PUMA可能是胰腺癌預(yù)后的判斷指標(biāo)和基因治療的靶點(diǎn)。 第二部分、胰腺癌細(xì)胞CAR受體表達(dá)與5型腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的關(guān)系 目的：通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討胰腺癌腫瘤細(xì)胞CAR表達(dá)水平與腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的關(guān)系，為腺病毒相關(guān)的生物制

6、劑在胰腺癌患者個(gè)體化應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：先將載有綠色熒光蛋白的Ad5型腺病毒（Ad—GFP）以100MOI分別感染人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC—1、CaPan—1、BxPC—3、Panc—1細(xì)胞6～96h，再以20～1000 MOI的Ad—GFP感染AsPC—1、CaPan—1、BxPC—3、Panc—1細(xì)胞24 h。感染結(jié)束后分別通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ad—GFP在不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。采用Western blotting、免疫組

7、化方法檢測(cè)這些細(xì)胞中CAR的表達(dá)水平。將CaPan—1、BxPC—3細(xì)胞分別接種于裸鼠背部，接種細(xì)胞數(shù)分別為5×106，建立裸鼠移植瘤模型。待腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)10mm時(shí)，在裸鼠移植瘤內(nèi)注射Ad—GFP1×108 pfu，試驗(yàn)分2組，第一組：1—14天內(nèi)動(dòng)態(tài)觀察腫瘤內(nèi)熒光的變化，第二組：3天處死裸鼠，剖取瘤組織，熒光顯微鏡觀察冰凍切片中GFP的表達(dá)情況以判定腺病毒在瘤體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，同時(shí)western blot法檢測(cè)瘤組織內(nèi)的CAR表達(dá)水平。

8、 結(jié)果：4種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率在24小時(shí)最高，AsPC—1、CaPan—1細(xì)胞在MOI50時(shí)，轉(zhuǎn)染效率近100%，Panc—1細(xì)胞在200MOI時(shí)轉(zhuǎn)染效率接近100%，而BxPC—3在MOI1000時(shí)，轉(zhuǎn)染效率為60%。各種細(xì)胞的CAR蛋白表達(dá)水平與腺病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率呈正相關(guān)。在注射Ad—GFP的裸鼠移植瘤組織中，3天可見CaPan—1瘤組織內(nèi)有明顯的綠色熒光，而BxPC—3瘤組織內(nèi)熒光強(qiáng)度少于前者；14天后熒光完全消失。冰凍切片發(fā)現(xiàn)C

9、aPan—1細(xì)胞內(nèi)明顯點(diǎn)狀熒光，而BxPC—3細(xì)胞熒光較弱。CAR在CaPan—1移植瘤組織的表達(dá)高于BxPC—3移植瘤組織，表明瘤體內(nèi)CAR表達(dá)水平與Ad—GFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也呈正相關(guān)。 結(jié)論：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示腫瘤細(xì)胞的CAR表達(dá)水平與5型腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率密切相關(guān)，胰腺癌患者治療前檢測(cè)組織中CAR表達(dá)水平有助于規(guī)范腺病毒載體的基因治療藥物個(gè)體化使用 第三部分、攜帶PUMA基因的重組腺病毒（Ad—PUMA）的構(gòu)建及制備

10、 目的：構(gòu)建含有人PUMA的重組腺病毒，為下一步轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞研究奠定基礎(chǔ)。 方法：以重組質(zhì)粒pCEP4—PUMA中提取的PUMA基因?yàn)槟０?，采用PCR法擴(kuò)增基因片段。將擴(kuò)增的基因片段插入穿梭質(zhì)粒pShuttle—CMV，并轉(zhuǎn)化大腸肝菌BJ—5183。篩選重組質(zhì)粒pShuttle—CMV—PUMA，與pAdEasy—1一起電轉(zhuǎn)化BJ5183細(xì)胞。篩選重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy—PUMA，用Lipofectamine轉(zhuǎn)染29

11、3細(xì)胞，制備攜帶人PUMA基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒（Ad—PUMA）。氯化銫密度梯度離心法純化Ad—PUMA病毒顆粒，并測(cè)定病毒滴度。 結(jié)果：①經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，證實(shí)Ad—PUMA構(gòu)建成功②限制性內(nèi)切酶酶切確定穿梭質(zhì)粒重組于病毒骨架；顯微鏡下觀察HEK293細(xì)胞形態(tài)，證實(shí)病毒包裝復(fù)制成功③病毒滴度2．032×1010pfu/ml，達(dá)到進(jìn)一步體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)要求。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad—PUMA，為了解PUMA在

12、胰腺癌中的治療作用奠定基礎(chǔ)。 第四部分、Ad—PUMA治療胰腺癌的體外研究 目的：探討Ad—PUMA對(duì)體外胰腺癌細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用和生長(zhǎng)抑制作用 方法：以不同MOI值的Ad—PUMA作用AsPC—1、CaPan—1、BxPC—3、Panc—1細(xì)胞，MTT檢測(cè)PUMA對(duì)細(xì)胞增殖的影響，PI染色、DNA Ladder、流式細(xì)胞儀檢測(cè)PUMA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PUMA蛋白表達(dá)的

13、變化以及Bax、Bcl—2、細(xì)胞色素C、Caspase—9，3表達(dá)的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase活性 結(jié)果：Ad—PUMA抑制胰腺癌細(xì)胞系細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)，并且PUMA抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)表現(xiàn)出時(shí)間依賴性和劑量依賴性，但PUMA對(duì)不同胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用并不相同，在相同條件下，Aspc—1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制最明顯，而BxPC—3的生長(zhǎng)抑制不明顯。DNA Ladder、FCM、PI染色分析檢測(cè)到明顯的Ad—PUMA誘導(dǎo)的細(xì)

14、胞凋亡。Western blotting發(fā)現(xiàn)，在PUMA表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl—2、細(xì)胞色素C、Caspases蛋白表達(dá)也隨著變化，caspases酶的活性明顯提高。 結(jié)論：PUMA通過促進(jìn)凋亡而抑制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，PUMA通過線粒體途徑發(fā)揮作用． 第五部分、Ad—PUMA治療胰腺癌的體內(nèi)研究 目的：探討Ad—PUMA對(duì)體內(nèi)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。 方法：建立裸鼠AsPC—1胰腺癌模型，待

15、瘤體生長(zhǎng)到10mm左右。治療前一天，移植腫瘤局部注射Ad—PUMA1×108PUF/ml/50ul，第3d注射第二次，第6d注射第3次，從治療前一天開始測(cè)量腫瘤體積，每2d測(cè)量一次至第21天。在治療21天，TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡、免疫組化檢測(cè)ki67了解細(xì)胞增殖，western blotting和RT—PCR檢測(cè)細(xì)胞PUMA表達(dá)的變化。 結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)組，腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢，21天后的腫瘤的體積明顯低于對(duì)照組，而細(xì)胞內(nèi)PUMA表達(dá)明

16、顯高于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖受抑制，細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。 結(jié)論：Ad—PUMA轉(zhuǎn)染促進(jìn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其生長(zhǎng)。 第六部分、Ad—PUMA聯(lián)合吉西他濱治療胰腺癌的體內(nèi)研究 目的：探討Ad—PUMA聯(lián)合吉西他濱對(duì)體內(nèi)外胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 方法：將AsPC—1細(xì)胞分別暴露于系列濃度的吉西他濱或系列濃度吉他西濱聯(lián)合5MOIAd—PUMA48h，MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率。按照上述方法建立裸鼠AsPC—1胰腺

17、癌模型，待瘤體生長(zhǎng)到10mm左右，吉西他濱、Ad—PUMA或兩者聯(lián)合治療移植瘤。于0、3、6天，腫瘤局部注射Ad—PUMA1×109PUF/ml/50ul，吉他西濱的給藥方式為腹腔注射，劑量為100mg/kg，于0、3、6天給藥。從治療前一天開始測(cè)量腫瘤體積，2d測(cè)量一次至21天。 結(jié)果：吉他西濱以劑量依賴方式抑制AsPC—1細(xì)胞增殖，但吉他西濱聯(lián)合Ad—PUMA后對(duì)AsPC—1細(xì)胞增殖的抑制更加明顯，聯(lián)合后的IC50為（0．0