1、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，關(guān)節(jié)炎發(fā)病在家禽家畜中均有存在，尤其對(duì)雞、豬、牛的危害較為嚴(yán)重。該病雖然致死率不高，但其一旦發(fā)病便難以痊愈，導(dǎo)致畜禽行動(dòng)不便，出現(xiàn)發(fā)育遲緩，經(jīng)濟(jì)價(jià)值降低甚至淘汰，由此給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失。已有研究發(fā)現(xiàn)將白細(xì)胞介素1受體(IL-1R)基因轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠，抑制了白細(xì)胞介素β(IL-1β)的作用，大鼠RA癥狀可得到明顯改善。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)生物學(xué)特性獨(dú)特并且參與多環(huán)節(jié)的免疫調(diào)節(jié)，具

2、有促進(jìn)損傷的修復(fù)的作用，因而被廣泛應(yīng)用于免疫性疾病的細(xì)胞治療。本實(shí)驗(yàn)利用Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)方法制備RA模型大鼠，初步探討RA發(fā)病的免疫機(jī)制。研究RA的發(fā)病與IL-1β表達(dá)量變化的關(guān)系，并用IL-1β小干擾RNA(SiRNA)體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)合BMSCs移植治療RA模型大鼠，研究BMSCs聯(lián)合基因治療對(duì)RA的治療效果。
　　1關(guān)節(jié)炎大鼠模型的制備及部分機(jī)制的研究
　　采用尾根部散點(diǎn)注射雞Ⅱ型膠原和完全復(fù)氏佐劑乳化液的方法制備類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)

3、節(jié)炎大鼠模型，實(shí)驗(yàn)組分為CIA、AA和正常組，造模后以大鼠足趾腫脹、強(qiáng)迫游泳、DR-X線成像、臟器指數(shù)、關(guān)節(jié)病理切片等進(jìn)行檢測(cè)，篩選出成功RA大鼠模型。通過(guò)對(duì)成功大鼠模型的血清中IL-1β、脾臟組織Treg的特異性標(biāo)志物Foxp3及Treg細(xì)胞表面的TGF-β1以及凋亡相關(guān)分子PD-1的研究，探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在RA發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　結(jié)果顯示，AA模型組和CIA模型組的大鼠體重增長(zhǎng)速度下降，CIA模型鼠減緩更明顯，CIA造模組

4、14天內(nèi)關(guān)節(jié)腫脹明顯，21天后大鼠左右關(guān)節(jié)腫脹達(dá)到病程的最高峰，30天后部分大鼠關(guān)節(jié)僵直、畸形、表面出現(xiàn)皮膚出現(xiàn)結(jié)節(jié)。CIA組和AA組大鼠脾臟、胸腺占體重指數(shù)極顯著高于正常對(duì)照組(p＜0.01);兩模型組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間從造模后1周、2周、3周、4周均極顯著高于正常組(p＜0.01)，掙扎時(shí)間均極顯著低于正常對(duì)照組(p＜0.01);關(guān)節(jié)滑膜組織切片顯示，大鼠模型關(guān)節(jié)軟骨有明顯的糜爛或潰瘍，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)腔內(nèi)有重度的混合型炎性細(xì)

5、胞浸潤(rùn)，另外還可見(jiàn)有多核巨細(xì)胞即肉芽腫的形成。AA模型組和CIA模型組大鼠造模后2周血清中IL-1β含量極顯著高于正常對(duì)照組（18.49±1.70 pg/mL、36.98±0.97 pg/mL vs16.23±0.44 pg/mL;p＜0.01），兩模型大鼠PD-1、TGF+1、Foxp3的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(p＜0.01)，同時(shí)CIA模型大鼠脾臟中PD-1、TGF-β1、Foxp3的表達(dá)量極顯著低于AA模型大鼠(p＜0.01)

6、。提示采用尾根部散點(diǎn)注射雞Ⅱ型膠原和完全復(fù)氏佐劑乳化液成功建立RA大鼠模型，且模型大鼠血清內(nèi)IL-1β的表達(dá)量隨RA病程而上升。RA的發(fā)生可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的減少或者功能缺陷有關(guān)。
　　2 IL-1β-siRNA干擾BMSCs中IL-1β表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
　　針對(duì)RA模型大鼠血清中IL-1β的含量顯著高于正常大鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用降低動(dòng)物機(jī)體IL-1β分泌技術(shù)，阻止炎癥反應(yīng)進(jìn)程，本實(shí)驗(yàn)利用LPS體外刺激BMSCs高表達(dá)IL-

7、1β，模擬RA體內(nèi)炎癥反應(yīng)，采用siRNA干擾技術(shù)體外干擾BMSCs表達(dá)IL-1β，通過(guò)ELISA法和Western blot對(duì)IL-1β蛋白水平表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，Q-PCR對(duì)IL-1β基因水平的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，篩選出最佳IL-1β SiRNA抑制基因。
　　LPS刺激后，LPS-BMSCs組與BMSCs組細(xì)胞上清以和裂解物中的IL-1β量存在極顯著差異(p＜0.01)，通過(guò)熒光強(qiáng)度篩選siRNA的最佳轉(zhuǎn)染條件為100nMsiR

8、NA與0.5ul轉(zhuǎn)染試劑的組合;siRNA干擾后，BMSCs培養(yǎng)上清中LPS-BMSCs組的IL-1β表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組（347.84±6.17 pg/mL vs119.38±2.92pg/mL; p＜0.01）;LPS+SiRNA157、LPS+SiRNA238、LPS+SiRNA788的表達(dá)量分別為126.21±2.25 pg/mL、52.66±1.72 pg/mL、101.83±3.65pg/mL均極顯著低于LPS-BMSCs

9、組(p＜0.01)。三條siRNA序列均可沉默IL-1β的蛋白表達(dá)，其中SiRNA238組的IL-1β表達(dá)極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。LPS+BMSCs+siRNA157、LPS+BMSCs+siRNA238、LPS+BMSCs+siRNA788的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著低于LPS+BMSCs(0.92±0.079、0.28±0.015、0.97±0.174 vs2.74±0.15; p＜0.01)，LPS+BMSCs+siRNA

10、238同時(shí)也極顯著低于正常對(duì)照組(p＜0.01)。提示LPS刺激BMSCs后成功模擬了體內(nèi)炎性反應(yīng)促進(jìn)了IL-β在胞內(nèi)外的過(guò)表達(dá)，蛋白水平、基因水平檢測(cè)篩選出IL-1β最佳干擾siRNA238。
　　3.IL-1β-siRNA聯(lián)合BMSCs對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療研究
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)IL-1β小干擾RNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)合BMSCs移植治療RA模型大鼠，以大鼠生長(zhǎng)情況、足趾腫脹、強(qiáng)迫游泳、關(guān)節(jié)病理切片、血清中IL-1β的含量等

11、進(jìn)行檢測(cè)，研究BMSCs聯(lián)合基因治療對(duì)RA的治療效果。對(duì)治療后老鼠脾臟組織Treg的特異性標(biāo)志物Foxp3及Treg細(xì)胞表面的TGF-β1以及凋亡相關(guān)分子PD-1進(jìn)行檢測(cè)，繼續(xù)探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在RA發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　IL-1β SiRNA238治療組和IL-1β SiRNA238+BMSCs治療組大鼠的體重增長(zhǎng)、足趾腫脹較PBS治療組都極顯著升高(p＜0.01)，IL-1β SiRNA+BMSCs治療組升高更明顯。IL-1β

12、 SiRNA治療組和IL-1β SiRNA+BMSCs治療組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間在治療后1周、2周極顯著低于治療對(duì)照組(p＜0.01)。治療后1周、2周、3周IL-1β SiRNA238+BMSCs治療組大鼠掙扎時(shí)間都極顯著高于IL-1β SiRNA238治療組(p＜0.01)。治療后1周、2周IL-1β SiRNA治療組大鼠和IL-1β SiRNA+BMSCs治療組大鼠血清中IL-1β的濃度極顯著低于PBS治療對(duì)照組(p＜0.01)，

13、且治療后1周、2周IL-1β SiRNA238+BMSCs治療組大鼠血清中IL-1β的濃度都極顯著高于IL-1β SiRNA238治療組(p＜0.01)。IL-1β SiRNA238治療組PD-1、TGF-β1、Foxp3的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于治療對(duì)照組(p＜0.01)，IL-1βSiRNA+BMSCs治療組PD-1、TGF-β1、Foxp3的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于治療對(duì)照組(p＜0.01)，IL-1β SiRNA+BMSCs治療組大鼠脾