1、目的：通過建立標準的大鼠類風濕性關節(jié)炎模型,觀察間充質干細胞在CIA模型中的免疫調節(jié)與組織修復功能。
　　對象與方法：1.SPF級體重160±20g左右wistar雄性大鼠,按照文獻報道方法建立標準的類風濕性關節(jié)炎模型。2.利用MSC體外貼壁生長的特性,體外培養(yǎng)人骨髓/臍帶MSC,獲得較純的MSC,通過分析細胞的表型及體外成脂肪和成骨能力,進行MSC鑒定。3.實驗分兩部分,第一,將大鼠分四組,預防組免疫次日及第8日腹腔注射骨髓MS

2、C,治療組從第三周開始每周一次腹腔注射骨髓MSC,細胞數均為1×107細胞/每只大鼠,對照組注射等量生理鹽水直至免疫結束。第二,觀察TNF-alpha處理MSC后,細胞內NF-kappaB核轉移情況,以及TNF-alpha處理對細胞增殖和混合淋巴細胞反應的影響。之后,將實驗大鼠分四組,免疫次日,A組腹腔注射臍帶MSC,B組腹腔注射經TNF-alpha(50ng/ml)處理48小時后的臍帶MSC,1×107細胞/每只,共四周,對照組等量生

3、理鹽水。治療結束后處死全部大鼠,膝關節(jié)病理切片及評分判定細胞治療效果。4.數據以平均值±標準差表示。用SPASS13.0軟件,采用t檢驗、單元方差分析及等級資料秩和檢驗方法,對資料進行統計學分析,p<0.05為顯著差異。
　　結果：1.動物模型的建立:CIA模型組首次免疫注射后,皮內注射部位及尾根部有多處小潰瘍、結節(jié),大約1周左右大鼠踝關節(jié)即開始出現紅腫,潰瘍結痂愈合。第14天趾關節(jié)全部出現紅腫,且踝關節(jié)開始受累,第21天達高峰,

4、之后腫脹趨于穩(wěn)定。在第28天逐漸出現關節(jié)畸形。自免疫后,模型組動物體重增長較正常大鼠明顯緩慢,在第27天有一過性體重下降現象.免疫結束后處死實驗組大鼠,膝關節(jié)病理可見滑膜增生、新生血管和炎細胞浸潤現象,病變可侵蝕至軟骨和骨,主要表現為廣泛的炎性細胞浸潤和關節(jié)腔粘連,符合類風濕性關節(jié)炎標準。2.人骨髓及臍帶MSC的培養(yǎng)及鑒定:骨髓單個核細胞或臍帶消化細胞接種24小時后,可以見到少量成纖維樣細胞貼壁生長、分散存在,培養(yǎng)6天后可見成纖維樣細胞

5、集落出現。流式檢測結果分析:MSC高表達CD44和CD73,不表達CD31,CD34和CD45。體外成骨誘導2周后,細胞堿性磷酸酶陽性。在成脂體系中培養(yǎng)第2周,進行油紅O染色,鏡下觀察細胞內脂肪小滴形成情況。結果表明培養(yǎng)的細胞符合MSC標準。3.第一部分結果表明,所有實驗組大鼠都出現了關節(jié)炎癥狀,而且在后期出現了關節(jié)畸形。細胞預防組與治療組關節(jié)炎評分顯著均高于對照組(p<0.01),6周時分別為9.5±0.5,9.4±0.6和7.6±0

6、.6,預防組和治療組之間無差異。病理學分析顯示,MSC預防與治療組膝關節(jié)滑膜炎和關節(jié)炎評分均高于模型組。此外,預防組、MSC治療組和對照組大鼠脾臟有核細胞中,CD86+百分比分別為4.16±1.48,4.06±1.97,4.15±2.04,各組CD11b/c+CD86+百分比分別為1.04±0.68,0.95±0.56,0.98±0.44,三組沒有顯著差異,但均高于健康大鼠(0.97±0.18和0.30±0.17,p均小于0.05)。第

7、二部分結果表明,TNF-α處理后,NF-kappa B迅速從胞漿內轉移至細胞核,但這種作用不影響MSC體外增殖。在不同細胞濃度條件下,無論TNF-α處理與否,MSC均可顯著抑制淋巴細胞增殖(p值均小于0.0001);TNF-α處理的MSC有更強的抑制作用,在低細胞濃度條件下尤為顯著。然而,病理分析顯示,細胞治療組關節(jié)炎性浸潤顯著加重,病理評分明顯高于未治療組(p<0.05)。
　　結論：1.利用多點注射牛II型膠原和弗氏完全/不完