1、第一章血管緊張素Ⅱ對NRK-52E中 klotho 基因表達的影響及Fosinopril 和 Valsartan 干預作用的研究。 第一節(jié)血管緊張素Ⅱ刺激klotho基因表達及Valsartan干預作用的研究。 目的:研究血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激后NRK-52E中klotho基因表達的狀況，探討Valsartan(Val)對klotho基因表達的影響。 方法:大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)與干預藥

2、物共培養(yǎng)。 1.按AngⅡ濃度梯度0(對照組)，10<'-9>，10<'-8>，10<'-7>，10<'-6>，10<'-5>mol/L 培養(yǎng)24小時，選擇最佳AngⅡ濃度按時間梯度0(對照組)，3，6，12，24 小時分組培養(yǎng)，用逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)檢測 klothomRNA 表達水平。 2.按Val濃度梯度0(對照組)，10<'-9>，10<'-7>，10<'-5>，10<'-3>mol/L 分組

3、培養(yǎng)24小時，RT-PCR檢測klotho mRNA表達。 結果: 1.AngⅡ調節(jié)NRK-52E中klotho mRNA表達呈量效抑制關系，但在時效關系上，klotho mRNA在3前小時被AngⅡ抑制，較對照組表達降低(P<0.05)，6～12小時klotho mRNA表達量逐漸增加，而24小時后klotho mRNA表達減少，呈明顯抑制狀態(tài)(P<0.05)。 2.不同濃度Val對NRK-52E中klo

4、tho mRNA表達與對照組相比無顯著差異，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3.AngⅡ可明顯抑制NRK-52E中klotho基因表達(P<0.05)，給予Val阻斷AngⅡ作用后，klotho基因表達增高(P<0.05)，而Val本身不影響klotho基因表達(P>0.05)。 第二節(jié)血管緊張素Ⅱ刺激klotho基因表達及Fosinopril干預作用的研究。 目的:研究 Fosinopril(Fo

5、s)對klotho基因表達的影響，探討Fosinopril影響AngⅡ下調klotho基因表達的機制。 方法: NRK-52E 與干預藥物共培養(yǎng)。1.按 Fos(10<'5>mol/L)時間梯度0(對照組)，3，6，12，24小時培養(yǎng)；按濃度梯度0(對照組)，10<'-9>，10<'-8>，10<'-7>，10<'-6>，10<'-5>mol/L分組培養(yǎng)24小時，用RT-PCR檢測klotho mRNA表達水平。2.設A.對照

6、組，B.AngⅡ(10<'-7>mol/L)組，C.Fos(10<'-5>mol/L)組，D.AngⅡ(10<'-7>mol/L)+Fos(10<'-5>mol/L)組，E.Fos(10<'-5>mol/L)干預12 小時后+AngⅡ(10<'-7>mol/L)共培養(yǎng)組，培養(yǎng)24小時，用RT-PCR和免疫組織化學法分別檢測 klothomRNA 和蛋白表達。 結果: 1.Fos對NRK-52E中klotho mRNA

7、表達呈時效依賴關系，隨著Fos (10<'->mol/L)干預時間的延長，klotho mRNA 表達逐漸增強，在12～24 小時klotho mRNA 表達較對照組顯著增加(P<0.05)，而量效關系不明顯(P>0.05)； 2.AngⅡ可抑制NRK-52E中klotho mRNA和蛋白表達(P<0.05)，給予Fos和AngⅡ共同培養(yǎng)，或Fos預先干預后均能抑制AngⅡ下調klotho mRNA 表達，與AngⅡ組比較差異

8、具有顯著性意義(P<0.05)。 第三節(jié) Fosinopril和Valaartan干預后NRK-52E中klotho基因表達狀況及 klotho 與 TGF-β<,1>關系研究。 目的:探討Fosinopril和Valsartan對Ang Ⅱ抑制klotho基因表達的干預作用及klotho與TGF-β<,1>的關系。 方法: NRK-52E與干預藥物共培養(yǎng)。實驗分五組，即對照組，Ang Ⅱ(10<'-7>m

9、ol/L)組，Ang Ⅱ(10<'-7>mol/L)+Fos(10<'-5>mol/L)組，AngⅡ (10<'-7>mol/L)+Val(10<'-5>mol/L)組，AngⅡ(10<'-7>mol/L)+Fos (10<'-5>mol/L)+Val(10<'-5>mol/L)組，培養(yǎng)24小時后收集細胞進行實驗。用RT-PCR檢測klotho和TGF-β<,1> mRNA表達；用免疫組織化學方法和western Blotting檢測k

10、lotho和TGF-β<,1>蛋白表達。對klotho和TGF-β<,1>蛋白表達進行直線相關分析。 結果: 1.AngⅡ誘導NRK-52E中TGF-β<,1> mRNA表達上調，同時使klothomRNA 表達下調，經Fos和/或Val干預后，TGF-β<,1> mRNA明顯受抑制，而klotho顯著上調表達(P<0.05)；Fos+Val聯(lián)合無增強klotho表達作用，與單純Fos組和Val組相比無統(tǒng)計學意義(P

11、>0.05)。 2. Fos，Val 和Fos+Val均明顯上調AngⅡ誘導下的klotho蛋白表達(P<0.05)，同時抑制TGF-β<,1>蛋白高表達(P<0.05)，Fos+Val兩者合用較單用Fos組或Val組中klotho和TGF-β<,1>蛋白表達水平無顯著性差異(P>0.05)(圖2-3-13)。 第二章 Fosinopril和Valsartan對NRK-52E中Angll-p53/Spl-klotho

12、 信號轉導通路的影響。 目的:探討Fosinopril和Valsartan對NRK-52E中AngⅡ-p53/Spl-klotho 信號轉導通路的影響。 方法: NRK-52E 與干預藥物共培養(yǎng)。實驗分五組，即對照組，Ang Ⅱ(10<-7>mol/L)組，Ang Ⅱ(10<'-7>mol/L)+Fos(10<'-5>mol/L)組，Ang Ⅱ(10<'-7>mol/L)+Val(10<'-5>mol/L)組，Ang

13、 Ⅱ(10<'-7>mol/L)+Fos(10<'-5>mol/L)+Val(10<'-5>mol/L)組，培養(yǎng)24小時后收集細胞進行實驗。用免疫組織化學法檢測p-p38，p38，p53，Sp1和TGF-β<,1>蛋白表達；用RT-PCR和Western Blotting分別檢測klotho mRNA和蛋白表達。并對相關指標進行相關分析。 結果: 1.在各組NRK-52E中總p38蛋白表達無顯著性差異(P>0.05)

14、，而在Ang Ⅱ組p-p38蛋白表達較對照組顯著增高(P<0.05)；在 Ang Ⅱ+Fos 組，AngⅡ+Val組和AngⅡ+Fos+Val組p-p38蛋白表達較AngⅡ組降低(P<0.05)，而三組間表達無明顯差異(P>0.05)。 2.在AngⅡ組p53和TGF-β<,1>蛋白表達較對照組明顯增高(P<0.05)，Fos和/或Val能顯著下調AngⅡ誘導的p53和TGF-β<,1>蛋白高表達。 第三章 Klot

15、ho 基因在自發(fā)性高血壓模型鼠腎組織中的表達及Fosinopril和Valsartan對其的干預作用。 目的: Fosinopril和Valsartan干預白發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，探討腎素-血管緊張素系統(tǒng)對klotho基因表達的調控及klotho基因在高血壓腎間質纖維化中的作用。 方法: 20只22周齡雄性SHR，隨機分為4組(5只/組)：高血壓組(SHR組)，Fosinopril組(Fos組)(Fos 10mg

16、/kg/d灌胃)，Valsartan組(Val組)(Val 50mg/kg/d灌胃)，Fosinopril+Valsartan組(Fos+Val組)(Fos10mg/kg/d+Val 50mg/kg/d聯(lián)合灌胃)；22周齡雄性Wistar-Kyoto大鼠(WKY組)5只為對照組。檢測各組大鼠體重，尾動脈血壓，24小時尿蛋白定量，尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)，左腎/體重比值和血肌酐。HE及Masson染色，顯微鏡下觀察腎

17、臟病理改變；用免疫組織化學法檢測腎臟組織中klotho和TGF-β<,1>蛋白表達；用RT-PCR和Western Blotting分別檢測腎臟組織中klotho，TGF-β<,1>和collagen ⅠmRNA和蛋白表達；對相關指標進行相關分析。 結果 1.實驗第8周(30周齡)，SHR組收縮壓明顯高于WKY組，Fos組，Val組及Fos+Val組(P均<0.05)，而Fos組，Val組及Fos+Val組收縮壓與W