1、第一部分:目的：觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（Transforming growth factor beta 1，TGF-β1）誘導(dǎo)的正常人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）轉(zhuǎn)分化（epithelial-to-mesenchymAltransition，EMT）過程中黏著斑激酶（FocAladhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達(dá)及下調(diào)FAK的表達(dá)后對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)程的影響。方法：應(yīng)用TGF-β1（10μg/L）刺激HK

2、-2細(xì)胞，采用RT-PCR, Western blot和免疫熒光方法分別檢測(cè)E-鈣粘蛋白(E-cadherin), α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscleactin, α-SMA），F(xiàn)AK Mrna和蛋白的表達(dá)及p-FAK (Tyr397)的蛋白表達(dá)。應(yīng)用Lipofectmine2000將FAK-siRNA 轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，采用Western blot 觀察下調(diào)表達(dá)FAK對(duì)上述指標(biāo)的影響。結(jié)果：TGF-β1刺激后，HK-2

3、細(xì)胞E-cadherin蛋白和Mrna表達(dá)下調(diào)，α-SMA蛋白和Mrna水平上調(diào)。FAK蛋白和Mrna 隨時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增多，48h 達(dá)到高峰。P-FAK (Tyr397)蛋白表達(dá)趨勢(shì)與FAK 相同。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA后FAK的Mrna和蛋白分別下降了61％和52％，下調(diào)表達(dá)FAK后可以顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞α-SMA蛋白的上調(diào)表達(dá)；逆轉(zhuǎn)E-cadherin蛋白的下調(diào)表達(dá)。結(jié)論：在TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分

4、化進(jìn)程中FAK蛋白表達(dá)上調(diào)，敲低FAK表達(dá)后可以部分減輕轉(zhuǎn)分化的程度，提示FAK在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和腎臟纖維化中發(fā)揮一定的作用。
　　
　　 第二部分:目的：探討?zhàn)ぶ呒っ福‵ocAladhesion kinase，F(xiàn)AK）在TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化進(jìn)程中的可能作用機(jī)制。方法：應(yīng)用Lipofectmine2000將FAK-siRNA轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞，并加入TGF-β1（10μg/L）刺激

5、，采用Western blot和免疫熒光方法分別檢測(cè)FAK，E-鈣粘蛋白(E-cadherin), Akt,基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9），金屬蛋白酶組織抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1），和IV型膠原（collagen IV，COL-IV）的蛋白表達(dá)，采用transwell方法檢測(cè)細(xì)胞遷移率。結(jié)果：（1）TGF-

6、β1刺激后，HK-2細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)逐漸增多, E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FAK-siRNA后可以顯著抑制FAK蛋白的增加并逆轉(zhuǎn)E-cadherin蛋白的下調(diào)表達(dá)。（2）TGF-β1可以誘導(dǎo)Akt的活化，即磷酸化的Akt 增多，但這種增加趨勢(shì)同樣被FAK-siRNA 所抑制。（3） PI3K/Akt的抑制劑LY294002能減輕TGF-β1導(dǎo)致的E-cadherin蛋白的下調(diào)，但不影響FAK的表達(dá)。（4）TGF-β1

7、可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞中MMP-9表達(dá)升高，TIMP-1和collagen IV表達(dá)下降，轉(zhuǎn)染FAK-siRNA后能減輕這些改變。（5）敲低FAK的表達(dá)能顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論：FAK在TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中發(fā)揮非常重要的作用，可通過PI3K/Akt 途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　
　　 第三部分:目的：觀察黏著斑激酶（FocAlAdhesion Kinase， FAK）在單側(cè)輸尿管梗阻

8、（unilaterAlureterAlobstruction，UUO）大鼠腎間質(zhì)纖維化中的表達(dá)，并探討其表達(dá)變化的意義。方法：（1）雄性SD大鼠16只隨機(jī)分成兩組：假手術(shù)組，單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）組。麻醉后打開腹腔，假手術(shù)組只分離左輸尿管不結(jié)扎，UUO組雙結(jié)扎左側(cè)輸尿管，手術(shù)后14天將各組大鼠處死。（2）生化指標(biāo)檢測(cè)：兩組大鼠處死前取血測(cè)血鉀、鈉、肌酐。（3）左側(cè)腎組織行Masson 染色分析判斷腎間質(zhì)纖維化程度。（4）免疫組化染色和

9、Western blot 觀察腎間質(zhì)FAK, E-cadherin，α-SMA的表達(dá)，并進(jìn)行圖像分析探討FAK和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：（1）兩組血清鈉，鉀無顯著性差異（p>0.05），血肌酐UUO組較假手術(shù)組顯著升高（p<0.05）。（2）Masson 染色示：與假手術(shù)組相比, UUO組大鼠腎小管明顯擴(kuò)張，腎間質(zhì)膠原纖維增加，纖維化程度明顯增加。（3）UUO組大鼠FAK，α-SMA的表達(dá)在腎小球和腎間質(zhì)均顯著升高，而E