1、目的：
　　1.建立一種同時檢測尿液非硫酸化和硫酸化膽汁酸代謝輪廓的超高液相色譜-三重四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Triple-TOF/MS）方法。
　　2.采用 UPLC-Triple-TOF/MS對正常妊娠組、輕度和重度妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥（Intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP）患者尿液膽汁酸代謝輪廓進(jìn)行分析，并運(yùn)用經(jīng)典判別分析以期獲得最優(yōu)的 ICP診斷模式，尋找潛在的生物

2、標(biāo)志物，為臨床 ICP的診斷、鑒別診斷及分度提供依據(jù)。
　　方法：
　　1.色譜條件：色譜柱Kinetex XB-C18(50×2.1 mm,1.7μm)，柱溫：30℃，流速：0.2 ml/min。流動相A：15 mmol/L醋酸銨，B:乙腈，梯度洗脫。質(zhì)譜條件：電離子噴霧源（ESI），采用負(fù)離子模式掃描，以各膽汁酸母離子質(zhì)量數(shù)±0.05 Da為目標(biāo)離子進(jìn)行子離子掃描，并以母離子作為定量離子。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，進(jìn)樣量5μl

3、，檢測時間20 min。
　　2.用Bond Elut C18固相萃取小柱進(jìn)行尿液樣品預(yù)處理。
　　3.采用Peakview數(shù)據(jù)處理軟件利用MS和MS/MS的精確質(zhì)量數(shù)據(jù)、特征碎片離子及同位素等信息，并與已知的膽汁酸比對，初步確定膽汁酸的種類。
　　4.采用UPLC-Triple-TOF/MS法對26例正常孕婦，14例輕度ICP患者，14例重度ICP患者進(jìn)行尿液膽汁酸代謝輪廓分析，并運(yùn)用經(jīng)典判別分析方法獲得最優(yōu)的ICP

4、診斷與分度模式，篩選出ICP靈敏、特異的生物標(biāo)志物。
　　結(jié)果：
　　1.有標(biāo)準(zhǔn)品的28種非硫酸化和1種硫酸化膽汁酸基本實(shí)現(xiàn)基線分離，通過鑒定初步認(rèn)識到尿液中40種可能硫酸化膽汁酸和17種與已知非硫酸化膽汁酸存在同分異構(gòu)的代謝物。
　　2.尿液膽汁酸的線性范圍為：0.020-20μmol/L，r為0.9925-1.0000，具有良好的相關(guān)性，最低檢測限0.001μmol/L。該方法的日內(nèi)變異系數(shù)均小于17.8％，日間變

5、異系數(shù)均不超過25.9%，各物質(zhì)在不同濃度下均獲得相對滿意的回收率。
　　3.與正常妊娠組相比，輕度和重度ICP組患者尿液非硫酸化與硫酸化膽汁酸均有不同程度的增高，而硫酸化膽汁酸的增加更為顯著；尿液結(jié)合型膽汁酸中，牛磺結(jié)合型膽汁酸較甘氨結(jié)合型膽汁酸增加更為顯著。
　　4.對于有標(biāo)準(zhǔn)品的膽汁酸，與正常妊娠組相比，輕度 ICP組GDCA、ω-TMCA和TCA顯著增高，GCDCA和GCA極顯著增高，重度ICP組α-TMCA、THC

6、A、GHCA、GCA和TLCA-S顯著增高，TUDCA和ω-TMCA極顯著增高；與輕度ICP組相比，重度ICP組TUDCA、ω-TMCA、THCA和TLCA-S顯著增高。
　　5.三組人群尿液中共檢測到27種可能的硫酸化膽汁酸與15種已知非硫酸化膽汁酸的同分異構(gòu)體代謝物，組間存在差異的主要有TBA-S、GBA-S、TCA-S、GCA-S、GLCA-S及TBA、GBA、TCA同分異構(gòu)代謝物。
　　6.經(jīng)典判別分析表明以本方法所

7、檢測的三組人群中有差異的40種膽汁酸為預(yù)測變量，正常妊娠組、輕度ICP組和重度ICP組的預(yù)測成功率分別為96.2%，92.9%，92.9%，判別函數(shù)對初始分組案例94.4%進(jìn)行了正確分類。
　　7.聯(lián)合VIP值、p(corr)值和組間存在差異的膽汁酸指標(biāo)綜合評價分析篩選出TBA3、TBA-S2、TUDCA、TCA5、TCA4和ω-TMCA對ICP的診斷和分度有重要價值，可能是臨床ICP診斷和分度潛在的生物標(biāo)志物。
　　結(jié)論：