1、背景：缺血性腦卒中是全球死亡率的第二大原因。系統(tǒng)研究腦缺血的治療和機制需要一個穩(wěn)定的、可復制性高的全腦缺血模型。盡管在許多研究模型中使用小鼠和沙鼠，但是可靠的全腦缺血大鼠模型也是實驗所需要的，并且有待進一步改善。四血管阻斷法是一種廣泛使用的全腦缺血模型。手術需要灼燒大鼠寰椎的翼狀孔，永久性阻斷雙側椎動脈。但是，術者往往無法直視下電凝椎動脈使其完全閉塞。因此，建立成功的模型需要依賴觀察大鼠的翻正反射和腦電圖表現。本課題需要建立一種穩(wěn)定的全

2、腦缺血模型，為后續(xù)實驗打好基礎。
　　血腦屏障是血漿與腦細胞之間的屏障，對中樞神經系統(tǒng)的內穩(wěn)態(tài)和正常功能的維持至關重要。血腦屏障內皮細胞的功能和形態(tài)與非腦組織毛細血管內皮細胞截然不同。在許多神經系統(tǒng)疾病中，血腦屏障的完整性會遭到破壞，例如缺血性腦卒中。腦缺血對血腦屏障的損傷作用已被廣泛研究。腦缺血缺氧會引起腦內一系列的分子變化，導致內皮細胞緊密連接破壞，血腦屏障通透性增加。許多研究證明腦缺血后雌激素可通過阻止血腦屏障的破壞從而保護

3、腦組織。雌激素的腦保護作用是由雌激素受體介導的（ERα、ERβ、GPER-1）。有研究表明ERα和ERβ可介導雌激素對腦缺血后血管內皮細胞連接蛋白的保護作用。但是，GPER-1在腦缺血導致的血腦屏障損傷中的作用目前還不清楚。
　　目的：
　　1.探索大鼠椎動脈與頸椎的位置關系，尋找阻斷大鼠椎動脈的最佳部位。
　　2.建立穩(wěn)定性高的新型全腦缺血模型，探索最佳缺血時間和最佳缺血部位。
　　3.探索全腦缺血對去勢大鼠海

4、馬CA1區(qū)血腦屏障以及GPER-1和VEGF-A表達的影響。
　　4.探索激動GPER-1受體是否可通過降低VEGF-A表達來保護全腦缺血大鼠CA1區(qū)血腦屏障。
　　方法：
　　1．采用CTA、DSA、血管乳膠灌注法明確大鼠椎動脈走行以及與頸椎的解剖關系。尋找阻斷大鼠椎動脈的最佳部位。
　　2．建立新型全腦缺血模型。根據全腦缺血10、20、30分鐘后大鼠的存活率，得出大鼠全腦缺血的最佳持續(xù)時間。隨后進行灌注、固定

5、、取腦，采用尼氏染色和TUNEL標記染色法觀察腦缺血后大鼠各個腦區(qū)神經元的死亡情況，評估新型全腦缺血模型的穩(wěn)定性。最后根據大鼠神經功能評分量表和膠帶實驗結果，觀察全腦缺血大鼠的行為學變化，進一步評估模型對大鼠行為學的損害情況。
　　3．采用Western blot實驗技術觀察全腦缺血20min后大鼠CA1區(qū)血腦屏障通透性的變化（IgG漏出率）和連接蛋白（Occludin、Claudin-5）的表達變化。同時也對腦缺血后的CA1區(qū)G

6、PER-1受體和VEGF-A蛋白的表達變化進行觀察。
　　4．采用Western blot和免疫熒光雙標染色觀察激動GPER-1受體對全腦缺血后大鼠CA1區(qū)血腦屏障通透性（IgG漏出率）和連接蛋白（Occludin、Claudin-5）表達的影響。隨后采用Western blot和免疫組織化學染色法探索激動GPER-1受體是否可通過降低VEGF-A表達來保護全腦缺血大鼠CA1區(qū)血腦屏障。
　　結果：
　　1.CTA、D

7、SA、血管乳膠灌注法結果發(fā)現，在頸1-頸2橫突間隙內椎動脈位于樞椎上關節(jié)突的外側深面，并且不受上關節(jié)突遮擋，頸后路手術可以在顯微鏡直視下輕松阻斷椎動脈。
　　2.生存分析結果顯示：10min全腦缺血大鼠術后7天的生存率達93％；20min全腦缺血大鼠術后7天的生存率達80%；30min全腦缺血大鼠術后7天的生存率僅為50%。制定20min為新型全腦缺血模型的最佳缺血時間。
　　3.尼氏染色結果顯示：20min全腦缺血大鼠CA

8、1區(qū)神經元數量在術后第1天無統(tǒng)計學差異，但在術后第3天出現明顯下降。在隨后的3-7天中，CA1區(qū)神經元數量沒有進一步下降。制定CA1區(qū)為新型全腦缺血模型的最佳缺血部位。
　　4.膠帶實驗和TUNEL染色結果證明全腦缺血大鼠在術后7天內皮層區(qū)和紋狀體區(qū)神經元均存在凋亡。新型全腦缺血模型可以導致大鼠運動整合能力相關腦區(qū)神經元損傷，并且這些神經元的損傷可以通過膠帶實驗進行觀察評價。
　　5.Western blot檢測結果顯示：全

9、腦缺血大鼠CA1區(qū)Occludin和Claudin-5蛋白含量在缺血后6小時開始降低，24小時明顯降低。后續(xù)實驗可以采用全腦缺血后24小時為觀察時間點。
　　6.Western blot和免疫熒光雙標染色結果顯示：激動GPER-1受體可以阻止缺血后OVX大鼠CA1區(qū)連接蛋白表達（Occludin和Claudin-5）的下降。另外還發(fā)現給予G-1激動劑后全腦缺血OVX大鼠CA1區(qū)VEGF-A表達明顯下降。
　　結論：
　

10、　1．新型全腦缺血模型可以穩(wěn)定的造成大鼠海馬CA1區(qū)神經元遲發(fā)性死亡，并引起大鼠神經功能出現異常。20min的全腦缺血為最佳缺血時間，CA1區(qū)為最佳缺血部位。
　　2．新型全腦缺血模型可以導致大鼠海馬CA1區(qū)血腦屏障的破壞，并且在缺血后24小時，CA1區(qū)血腦屏障破壞最為明顯。
　　3．激動GPER-1受體可在腦缺血早期起到穩(wěn)定血腦屏障通透性的作用。激動GPER-1受體可以通過減少VEGF-A的表達來穩(wěn)定缺血CA1區(qū)血腦屏障的