1、文昌魚(Amphioxus)屬頭索動物(Cephalochordata)，代表著從無脊椎動物到脊椎動物進化過程中一個重要的過渡階段。一方面，文昌魚形體結構的基本特征與脊椎動物的祖先極為相似，使之成為研究脊椎動物形體模式發(fā)生機制進化的最佳模型。另一方面從比較基因組的角度看，文昌魚與脊椎動物的祖先歧化后獨立進化長達5.5億年，其自身種系的進化史和特有的基因倍增、功能分化和基因丟失也不容忽視。近些年的研究表明，對脊椎動物和與它親緣關系接近的類

2、群之間進行比較基因組分析，發(fā)育調控基因的系統(tǒng)進化分析，以及比較發(fā)育生物學的研究，可以提供很多有關脊椎動物起源和進化的線索，進一步揭示進化過程中基因和發(fā)育調控是如何改變的。因此雖然文昌魚不是脊椎動物的直接祖先，但是它是現(xiàn)存的與脊椎動物直接祖先最接近的無脊椎動物，是研究動物進化和動物胚胎發(fā)育的典型材料。 本文首次報道了圍繞文昌魚發(fā)育相關基因AmphiSom、Tropomyosin和eIF3k的研究工作。 首先介紹文昌魚體

3、節(jié)分化相關基因AmphiSom。最初，AmphiSom是從文昌魚18h cDNA文庫中獲得的一個長度為1200bp的序列，利用生物學軟件分析其可能有一個編碼154個氨基酸的開放閱讀框，分析cDNA序列發(fā)現(xiàn)在我們假定的起始密碼子之前有同框的終止密碼子，由此推測得到了一個完整的文昌魚AmphiSom的開放閱讀框。SouthernBlotting中，用多種內切酶酶切后的基因組DNA與隨機引物標記的AmphiSom DNA探針雜交，結果只有一條

4、帶存在，顯示在文昌魚中AmphiSom可能只有一個拷貝。原位雜交結果顯示AmphiSom的轉錄表達分為兩個階段。首先在早于文昌魚受精后9h以前的發(fā)育階段沒有檢測到AmphiSom的轉錄本。從原腸胚晚期/神經(jīng)胚早期(受精后9h)開始，AmphiSom的轉錄產(chǎn)物位于前三個初生體節(jié)以及預定體節(jié)中胚層(PSM)；隨著早期胚胎的不斷發(fā)育，觀察到AmphiSom隨著體節(jié)的形成，在正在形成中的體節(jié)和初生體節(jié)中保持較強的表達，同時，在已經(jīng) 形成的體節(jié)

5、中，表達迅速下調；整個神經(jīng)胚期，AmphiSom在新生體節(jié)和正在形成的體節(jié)中的雜交信號可以很明顯的觀察到；之后隨著發(fā)育的進行，肌節(jié)中的AmphiSom轉錄產(chǎn)物開始由前向后沿著前后軸逐漸減少，即仍然在發(fā)育中的肌節(jié)中保留，但雜交信號逐漸減弱，在已形成的體節(jié)中逐漸消失，在尾芽中有著強表達；在幼蟲時期，沿前后軸的最后端尾芽處仍能觀察到AmphiSom的轉錄產(chǎn)物；在受精后72h的幼蟲中未檢測到AmphiSom的雜交信號。我在成體的切片原位雜交中，

6、發(fā)現(xiàn)AmphiSom在卵巢、肝盲囊、腸壁和微血管中有表達。 通過文獻可以得知，Wnt信號與體節(jié)的分化相關，而LiCl處理胚胎又會影響wnt信號通路，因此我利用AmphiMRF2作為參照，進一步研究了AmphiSom在LiCl處理胚胎中的表達圖式。對文昌魚AmphiMRF2和AmphiSom發(fā)育表達模式的比較研究表明，這兩個基因在神經(jīng)胚期的表達區(qū)域均擴大，表達強度都有所加強，不僅在中胚層在內胚層也有所表達。因此我認為AmphiSom

7、可能和Wnt信號通路有一定的關系，為了進一步研究AmphiSom的功能，我構建了AmphiSom的體內表達載體。 其次，因試圖對文昌魚的脊索、肌肉以及體節(jié)的發(fā)育有一個系統(tǒng)的研究，我又合成引物得到了文昌魚的Tropomyosin基因。利用RT-PCR的方法得到它的全長，該基因編碼一段284個氨基酸殘基的多肽，和其他物種的Tropomyosin有很高的同源性。將文昌魚丁Tropomyosin和在其他物種中的同源物進行比對建樹，發(fā)

8、現(xiàn)和傳統(tǒng)的分類學觀點一致。通過原位雜交我了解到，Tropomyosin在文昌魚早期發(fā)育的表達最早從原腸胚晚期神經(jīng)胚早期開始，在原腸胚期定位于分化中的中內胚層。到神經(jīng)胚期，Tropomyosin，的表達出現(xiàn)在發(fā)育中的體節(jié)和脊索中。隨著發(fā)育的進行，Tropomyosin的表達穩(wěn)定的集中在體節(jié)、脊索處。到72小時幼蟲階段，Tropomyosin的表達仍然在肌節(jié)內。成體的切片原位雜交結果顯示，在文昌魚成體中，Tropomyosin肌節(jié)中的表達大

9、幅度下調，只有很微弱表達，而在神經(jīng)管細胞和脊索處仍然可以檢測到表達的明顯存在，在外胚層和表皮內沒有發(fā)現(xiàn)雜交信號。研究結果表明，Tropomyosin的 表達不僅與文昌魚多種早期發(fā)育事件相關，參與文昌魚胚胎軀體模式的構建，而且在成體的生命活動中發(fā)揮重要作用。 通過cDNA文庫的大規(guī)模的測序，我得到一段EST，經(jīng)過Blast比對發(fā)現(xiàn)和其他物種elF3k基因有著很高的同源性。該cDNA有930bp個堿基組成。與人，小鼠，挪威鼠，狗，牛

10、，斑馬魚，爪蟾，果蠅同源基因的同源性都在67％以上。并且該編碼蛋白含有elF3k蛋白特殊的結構域，我們命名該基因為文昌魚elF3k基因。我用總共11個不同物種的elF3k同源物比對進行建樹，分析該基因的系統(tǒng)進化。并且通過原位雜交研究其在文昌魚中的表達模式。原位雜交結果顯示，文昌魚中elF3k最初從卵裂期開始表達，集中在受精卵和四細胞期的細胞質中。到了囊胚期，elF3k的表達下調，逐漸消失，一直持續(xù)到原腸胚期，整個胚胎中都檢測不到elF3

11、k的轉錄本，到了12小時神經(jīng)胚期，文昌魚elF3k的表達逐漸出現(xiàn)在神經(jīng)外胚層和背部中胚層中，神經(jīng)板區(qū)域有著明顯的表達。隨著發(fā)育的進行，到了神經(jīng)胚晚期，elF3k的表達主要集中在消化道和肌節(jié)，并且隨著發(fā)育的進行，文昌魚elF3k穩(wěn)定的表達在神經(jīng)管、體節(jié)和消化管壁中，一直到幼蟲階段我發(fā)現(xiàn)elF3k在鰓區(qū)有著特異性的表達。在文昌魚成體中，elF3k的表達并不象胚胎中在肌肉中有著明顯的表達，elF3k在肌肉中的表達下調，表達區(qū)域主要集中在神經(jīng)管

12、、肝盲囊、腸和體腔壁，尤其在神經(jīng)索中有著強烈的表達。說明文昌魚elF3k足基因也許和文昌魚的神經(jīng)形成以及神經(jīng)功能的行使相關，對于進一步的研究神經(jīng)系統(tǒng)的進化有著比較重要的意義。 鐵在所有的細胞的代謝中起著重要的作用，例如細胞氧的運輸、電子傳遞、DNA的復制、光合作用和細胞的增殖等代謝過程都與鐵的功能密切相關。同時鐵是一些蛋白質的必需成分(例如在酶，輔因子中)。對于生物體而言，在細胞內鐵的代謝和其穩(wěn)態(tài)的維持是必須的，由轉鐵蛋白

13、進行鐵的吸收和通過鐵蛋白ferritin進行的鐵的匯集共同形成了鐵的穩(wěn)態(tài)。細胞內鐵穩(wěn)態(tài)的控制一般是通過后翻譯調控來控制的。但是 由于鐵的不可溶性，若在胞質內自由存在對細胞會產(chǎn)生毒性，所以體內需要存在儲存鐵的蛋白質。鐵蛋白ferritin (apo ferritin-fecomplex)是在很多生物有機體中發(fā)現(xiàn)的一個鐵貯存和礦化蛋白。我研究和報道了文昌魚鐵蛋白ferritin一個亞基的同源基因的全長cDNA序列，對文昌魚鐵蛋白ferri