1、目的：探討新型突變mucA56基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位，并觀察mucA56基因?qū)ι锉荒ば纬傻挠绊懀接憁ucA56基因影響生物被膜形成的機(jī)制。
　　 方法：采用含NcoI和XbaI 酶切位點(diǎn)的引物，從Pmd18t-HR擴(kuò)增mucA56基因的全長(zhǎng)克隆到Pmf54構(gòu)建Pcaq56，XbaI單酶切Ppho7載體中的堿性磷酸酶基因全長(zhǎng)插入到Pcaq56的開放閱讀框中，構(gòu)建mucA56-phoA融合表達(dá)載體Pcaq57。對(duì)構(gòu)建的Pcaq

2、57載體進(jìn)行PCR鑒定及序列測(cè)定，并使用堿性磷酸酶抗體驗(yàn)證融合蛋白的表達(dá)。將Pcaq57、Pkmg170(陰性對(duì)照質(zhì)粒)、Pkmg176（陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒）分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌和銅綠假單胞菌，劃線接種在含有堿性磷酸酶作用底物BCIP的LB瓊脂平板上，觀察各自菌落顏色以評(píng)估堿性磷酸酶活性；從pGFPuv質(zhì)粒中擴(kuò)增表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的基因全長(zhǎng)，克隆入大腸桿菌-銅綠假單胞菌穿梭質(zhì)粒（Pucp20），構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定的銅綠假單胞菌綠色熒光蛋白表達(dá)載體（

3、Pucp20/GFPuv），采用電轉(zhuǎn)化的方式將Pucp20/GFPuv導(dǎo)入到銅綠假單胞菌PAO1、PDO300(含經(jīng)典突變mucA22基因的粘液型PAO1同源菌株）、PAOmucA56（含新型突變mucA56基因的粘液型PAO1同源菌株）中，采用改良的流動(dòng)介質(zhì)體外培養(yǎng)生物被膜，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察生物被膜形成第1、3、5天的形態(tài)和結(jié)構(gòu)；收集三者生物被膜形成第一、三、五天的生物被膜細(xì)菌，提取細(xì)菌全蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)二維電泳，找出PAO1、

4、PAOmucA56表達(dá)水平相同而與PDO300表達(dá)水平差異的蛋白點(diǎn)，采用基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF MS)分析差異蛋白質(zhì)。
　　 結(jié)果：對(duì)構(gòu)建的融合表達(dá)載體Pcaq57進(jìn)行PCR鑒定及序列測(cè)定，結(jié)果表明phoA基因正向插入到mucA56的開放閱碼框中；Western Blot進(jìn)一步證實(shí)了融合蛋白的表達(dá)；以上提示成功構(gòu)建了mucA56-phoA融合蛋白表達(dá)載體Pcaq57。轉(zhuǎn)化了Pcaq57的大腸桿菌和銅

5、綠假單胞菌，以及轉(zhuǎn)化了Pkmg170的大腸桿菌和銅綠假單胞菌，在含有堿性磷酸酶作用底物BCIP的LB瓊脂平板上，均表現(xiàn)為白色菌落，提示為無(wú)活性的堿性磷酸酶活動(dòng)。而轉(zhuǎn)化了Pkmg176的大腸桿菌和銅綠假單胞菌，在含有堿性磷酸酶作用底物BCIP的LB瓊脂平板上均表現(xiàn)為藍(lán)色菌落，提示為有活性的堿性磷酸酶活動(dòng)；激光共聚焦顯微鏡觀察PAOmucA56、PAO1、PDO300第1、3、5天生物被膜形態(tài)，結(jié)果顯示：PAOmucA56、PAO1的形成方

6、式為水平鋪散，其成熟生物被膜形態(tài)為均一的薄膜狀，基質(zhì)覆蓋完全，PAOmucA56成熟生物被膜平均厚度約為30mm，PAO1成熟生物被膜平均厚度約為25mm；PDO300的形成方式為局部堆積，呈山丘狀，成熟生物被膜具有很大的異質(zhì)性，以低的基質(zhì)覆蓋和大的微生物菌落間隔為特點(diǎn)，生物被膜最高厚度約為36mm。生物被膜形成第一天、第三天、第五天的生物被膜細(xì)菌全蛋白二維電泳，PAO1和PAOmucA56表達(dá)相同而與PDO300差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)分別有

7、8個(gè)、6個(gè)、15個(gè)。29個(gè)蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果表明，有12個(gè)蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果可信度不高（MS﹤66）。篩選出來(lái)的17個(gè)候選蛋白中，DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶b亞單位、谷氨酰胺合成酶、延長(zhǎng)因子Tu、DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶a亞單位、內(nèi)肽酶Clp2、延長(zhǎng)因子G1、熱休克蛋白 HtpG、ATP依賴的Clp蛋白ATP結(jié)合亞單位 clpX、觸發(fā)因子在PDO300中相對(duì)低表達(dá)，而30S核糖體蛋白S18、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸脫氫酶復(fù)合物二氫硫辛

8、酰賴氨酸基乙酰轉(zhuǎn)移酶、PasP、生物素羧化酶、精氨酸脫亞氨酸、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶3在PDO300中相對(duì)高表達(dá)；其中clp蛋白酶家族（內(nèi)肽酶Clp2和ATP依賴的Clp蛋白ATP結(jié)合亞單位 clpX）分別在第三天、第五天生物被膜細(xì)菌中有PDO300的相對(duì)低表達(dá)。
　　 結(jié)論：mucA56基因編碼的產(chǎn)物定位在細(xì)胞質(zhì)；藻酸鹽可以影響生物被膜結(jié)構(gòu)，而mucA56基因存在藻酸鹽以外的途徑影響生物被膜的形成；mucA56