1、背景與目的：慢性阻塞性肺疾病(COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病,患病率和病死率均居高不下,嚴重影響患者的勞動力和生活質(zhì)量。COPD造成巨大的社會和經(jīng)濟負擔,根據(jù)世界銀行/世界衛(wèi)生組織發(fā)表的研究,至2020年COPD將成為世界疾病經(jīng)濟負擔的第五位。在我國,COPD同樣是嚴重危害人民身體健康的重要慢性呼吸系統(tǒng)疾病。近期對我國7個地區(qū)20245成年人群進行調(diào)查,COPD患病率占40歲以上人群的8.2％,其患病率之高十分驚人。COPD發(fā)病機

2、制尚未完全明了,但吸煙是導致COPD的最常見原因。
　　 COPD病情呈進行性發(fā)展,病理學改變累及肺臟的多級結(jié)構(gòu),包括中央及周圍的氣道、肺實質(zhì)乃至肺血管,屬于不可逆性病變,依靠機體自身的能力無法達到組織的完全修復。根據(jù)COPD診治指南,現(xiàn)有的可行性治療方案包括藥物治療、氧療、康復治療及外科治療,但現(xiàn)有的這些治療手段僅僅從減輕癥狀,阻止病情發(fā)展；改善活動能力,提高生活質(zhì)量出發(fā)。因此,迫切需要尋找到能夠從根本上修復和重建肺部組織結(jié)構(gòu)

3、的的有效方法。
　　 間充質(zhì)干細胞(MSCs)是中胚層來源的具有多向分化能力的干細胞,國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)MSCs在特定條件下具有向中胚層(如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞等)、外胚層(神經(jīng)纖維等)和內(nèi)胚層(如肺上皮細胞、肝細胞等)來源的多種組織細胞分化的能力,是組織工程、細胞及基因治療理想的靶細胞。它不僅具有取材方便、培養(yǎng)容易、增殖較快等特點,免疫原性也較低,低表達MHCⅠ、不表達MHCⅡ,提示在進行同種異體間輸注時,不會產(chǎn)生

4、排斥反應。對MSCs的深入研究發(fā)現(xiàn)當有組織器官受損時,間充質(zhì)干細胞能夠優(yōu)先定位于受損傷的靶器官,這與移植方式、移植途徑和移植后的時間無明顯關系。有研究報道,體外標記MSCs后將其移植入肺損傷的動物體內(nèi),MSCs可以大量定位到損傷的肺組織中,并能在損傷的肺組織內(nèi)分化成肺泡上皮細胞。此外,它可以在損傷組織局部分泌一些營養(yǎng)因子、生長因子,這些細胞因子可能參與修復損傷的肺組織。
　　 目前對于慢性阻塞性肺疾病的治療僅僅停留在緩解、改善的

5、水平上,未能從根本上解決問題。本實驗基于MSCs這些特性進行干預治療,采用同種異體MSCs進行輸注,研究MSCs治療大鼠COPD的效果。
　　 實驗方法：
　　 第一部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與鑒定
　　 實驗在無菌條件下分離大鼠肱骨、股骨,用無血清培養(yǎng)基沖出骨髓,離心后接種含1096胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基中,按2×106/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中,置于孵箱中培養(yǎng)。48h后半量換液,第五

6、天全量換液,待細胞生長至80-90％融合時,0.25％胰酶消化傳代。取生長狀態(tài)良好的第三代骨髓間充質(zhì)干細胞倒置顯微鏡和瑞士-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài),流式細胞術(shù)進行細胞周期分析,用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD45、CD29及CD44的表達,進行細胞鑒定。
　　 第二部分、大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立
　　 選取10只雄性SD大鼠隨機分為兩組,即對照組和模型組。模型組大鼠煙霧暴露80天,對照組常氧下飼養(yǎng)。80天

7、后,水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈插管取血1ml送血氣分析；蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察大鼠肺部病理改變；平均內(nèi)襯間隔(MLT)及平均肺泡數(shù)(MAN)評估肺氣腫程度。
　　 第三部分、MSCs治療大鼠慢性阻塞性肺疾病效果的研究
　　 選取15只雄性SD大鼠隨機分為三組,即對照組、模型組和治療組。模型組和治療組大鼠煙霧暴露80天,對照組常氧下飼養(yǎng)。其中治療組大鼠在煙霧暴露80天后每只大鼠每周注射一次間充質(zhì)干細胞,數(shù)量為3.

8、6×106個,連續(xù)四周進行治療,模型組和對照組大鼠同期尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)大鼠1月后,腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈插管取血1ml送血氣分析；提取大鼠血清,制備肺組織勻漿,采用硫代巴比妥酸和黃嘌呤氧化法分別檢測血清和肺組織中MDA含量和SOD活性；行支氣管肺泡灌洗,測支氣管肺泡灌洗液中(BALF)白細胞總數(shù)及分類計數(shù)細胞；蘇木精-伊紅染色(HE染色)評估大鼠肺部病理改變,用平均內(nèi)襯間隔(MLT)及平均肺泡數(shù)(MAN

9、)評估肺氣腫程度；從生理學、形態(tài)學、生化學等水平探討MSCs是否具有治療慢性阻塞性肺疾病的作用。
　　 第四部分、MSCs向慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織趨化的研究
　　 用PKH26標記P3代MSCs,熒光顯微鏡下觀察細胞。瑞士-吉姆薩染色觀察PKH26對細胞形態(tài)的影響；檢測標記后的MSCs的生長曲線以了解PKH26對細胞的增殖的影響。分別經(jīng)尾靜脈輸入PKH26標記后的MSCs3.6×106個到COPD及正常大鼠體內(nèi),同時

10、輸入同等量未標記的MSCs到另一組COPD大鼠體內(nèi)作為陰性對照。一周后,處死大鼠,制作肺組織冰凍切片。熒光顯微鏡下觀察。取大鼠肺組織,研磨后經(jīng)300目篩網(wǎng)過濾,取肺組織1×106個細胞制作懸液涂片,在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù),以探討MSCs能否向慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺組織中趨化。
　　 統(tǒng)計學方法：
　　 實驗資料結(jié)果用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,選取檢驗水準為α=0.05,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析

11、。模型評價采用兩獨立樣本t檢驗(Independent Sampies T—Test)；評估治療效果的組間比較用單因素方差分析(one—Way ANOVA)。標記后的細胞及未標記細胞隨時間的增殖變化用配對樣本t檢驗(Paired Sampies T—Test)；用Leyene進行方差齊性檢驗,組間兩兩顯著性比較方差齊采用LSD法,方差不齊用Dunnett T3。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)與

12、鑒定
　　 ①本實驗分離的骨髓間充質(zhì)干細胞于48h后貼壁生長,全量換液后可見細胞呈星形、多邊形和不規(guī)則形；10天左右時,細胞即可融合近80％。傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)基本上趨于一致,經(jīng)瑞士一吉姆薩染色后光鏡下見細胞呈梭形,核圓,色紫藍,位于細胞中央,胞質(zhì)肥大,胞膜清晰；
　　 ②流式細胞術(shù)證明G0+G1期的細胞約占80％以上,說明MSCs在體外具有只增殖不分化的特點；
　　 ③經(jīng)流式細胞儀檢測,Cell Quest軟件

13、分析,結(jié)果顯示第3代MSOs的特異性表面標志物:CD34-/CD45-/CD29+/cD44+,CD29+陽性率為99.9％,CD44+陽性率為97.8％:結(jié)合以上說明本實驗培養(yǎng)的細胞為間充質(zhì)干細胞。
　　 第二部分、大鼠慢性阻塞性肺疾病模型的建立
　　 ①血氣分析:檢測動脈血氧分壓(P()2)顯示對照組和模型組分別為:83.00±6.94、72.20±5.404mmHg,模型組氧分壓顯著低于對照組(t=2.740,P=

14、0.025)；二氧化碳分壓(PCO2)分別為37.00±3.16、40.8±7.36mmHg,兩者比較無顯著統(tǒng)計學意義(t=1.060,P=0.320)。
　　 ②病理觀察:對照組鏡下可見正常氣管及各級支氣管上皮纖毛豐富,排列整齊,在纖毛細胞間夾雜有少數(shù)杯狀細胞,管壁內(nèi)有少數(shù)散在的淋巴細胞。模型組肺體積較對照組增大,顏色蒼白,部分肺表面可見多個大小不等的過度充氣肺大皰。光鏡下可見炎癥細胞浸潤,肺泡大小不等,肺泡壁變薄,并有不同程

15、度的斷裂,部分融合成肺大皰。
　　 ③定量病理:結(jié)果顯示對照組、模型組MLI分別為:45.86±3.45μm/個,79.32±7.93μ m/個,模型組肺MLI顯著高于對照組(t=-25.638,P<0.001):MAN分別為:396.18±19.00個/m2,213.42±19.00個/m2,模型組MAN顯著低于對照組(t=44.481,P<0.001)。
　　 第三部分、MSCs治療大鼠慢性阻塞性肺疾病效果的研究

16、r>　　 ①觀察大鼠的一般狀態(tài):對照組大鼠在實驗過程中進食正常,毛發(fā)光滑,生長良好,無明顯的呼吸道癥狀。模型組大鼠逐漸出現(xiàn)毛發(fā)脫落、萎黃、無光澤、反應遲鈍、活動減少、呼吸頻率增快并出現(xiàn)噴嚏、喘息等呼吸道癥狀。治療組大鼠精神狀態(tài)一般,毛發(fā)微黃,反應較模型組靈敏,呼吸道癥狀較模型組緩解。
　　 ②血氣分析檢測動脈血氧分壓(PO2)及二氧化碳分壓(PCO2)結(jié)果顯示:模型組氧分壓顯著低于對照組,而治療組較模型組的氧分壓顯著增高(F=

17、5.941,P=0.016)；對照組、模型組及治療組二氧化碳分壓組間比較無統(tǒng)計學差異(F=0.823,P=0.463)。
　　 ③采用硫代巴比妥酸和黃嘌呤氧化法分別檢測血清SOD的活性及MDA含量,結(jié)果顯示:對照組、模型組及治療組血清SOD的活性分別為100.88±2.18U/ml,34.93±5.04 U/ml,80.91±6.70U/ml(F=67.941,P<0.001)；MDA含量分別為5.66±0.08nmol/ml、

18、10.84±0.65 nmol/ml、5.78±0.22nmol/ml(F=50.288,P(0.001),模型組與對照組、治療組與模型組進行兩兩比較,差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 ④采用硫代巴比妥酸和黃嘌呤氧化法分別檢測肺組織中SOD的活性及MDA含量,結(jié)果顯示:對照組、模型組及治療組血清SOD的活性分別為133.91±6.27U/mg prot,100.45±4.03 U/mg prot,131.29±10.97 U/mgpr

19、ot(F=50.726,P<0.001),MDA含量分別為5.32±0.80 nmol/mg prot,8.43±1.01 nmol/mg prot,5.43±1.07 nmol/mg prot(F=23.838,P<0.001),模型組與對照組、治療組與模型組組間比較,差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 ⑤檢測支氣管肺泡灌洗液白細胞總數(shù)及分類計數(shù)結(jié)果顯示:對照組、模型組及治療組白細胞總數(shù)分別為1.85±0.2.0×108/L,4.27

20、±0.74×108/L,2.23±0.416×108/L(F=39.546,P<0.001),模型組與對照組、治療組與模型組組間比較,差異具有統(tǒng)計學意義；巨噬細胞總數(shù)分別為:1.68±0.2.0×108/L,3.36±0.69×108/L,1.98±0.39×108/L(F=23.088,P<0.001),模型組與對照組、治療組與模型組組間比較,差異具有統(tǒng)計學意義；中性粒細胞總數(shù)分別為0.08±0.015×108/L,0.61±0.09

21、6×108/L,0.13±0.020×108/L((F=207.437,P<0.001),模型組與對照組、治療組與模型組組間比較,差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 ⑥觀察肺部形態(tài)學改變:模型組大鼠肺臟體積明顯增大、膨脹,顏色蒼白,彈性差,光鏡下見炎癥細胞浸潤,肺泡大小不等,肺泡壁變薄,并有不同程度的斷裂,部分融合成肺大皰,MSCs治療組較模型組明顯改善。
　　 ⑦定量病理結(jié)果顯示對照組、模型組、治療組MLI分別為:45.03±

22、3.66μm/個,79.67±8.29μm/個,56.90±4.31μm/個(F=409.599,P<0.001),模型組與對照組、治療組與模型組組間比較,差異具有統(tǒng)計學意義；MAN分別為:407.48±19.32、206.30±23.38、331.27±24.939(106個/m2)(F=903.076,P<0.001),模型組與對照組、治療組與模型組組間比較,差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 第四部分、MSCs向慢性阻塞性肺疾病大

23、鼠肺組織趨化的研究
　　 ①PKH26標記骨髓間充質(zhì)干細胞不影響細胞形態(tài)及細胞的增殖。
　　 ②將間充質(zhì)干細胞輸入大鼠體內(nèi),在熒光顯微鏡下觀察,輸入標記后的MSCs的COPD及正常大鼠的肺組織中均可見紅色明亮熒光,輸入未標記的MSCs大鼠肺組織未見紅色明亮熒光。計數(shù)熒光細胞進行組問比較(F=122.588,P<0.001),具有顯著統(tǒng)計學差異。COPD組大鼠的熒光細胞數(shù)較正常對照大鼠顯著增高。
　　 結(jié)論：

24、>　　 1、本實驗方法能有效地獲得骨髓間充質(zhì)干細胞,采用貼壁法培養(yǎng)的骨髓細胞經(jīng)鑒定為間充質(zhì)干細胞。
　　 2、本實驗采用的煙熏80天的方法能夠成功構(gòu)建大鼠COPD模型。
　　 3、本實驗從生理學、形態(tài)學、生化等方面檢測,發(fā)現(xiàn)MSCs能夠起到改善和修復大鼠的慢性阻塞性肺疾病損傷的作用,說明骨髓間充質(zhì)干細胞輸注具有治療大鼠慢性阻塞性肺疾病的效果。
　　 4、MSCs具有向慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織趨化的能力。